实验六氨基酸的纸层析法

1、氨基酸的纸层析法一. 目的了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。二、原理以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大 多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力 强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上 又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两 相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸 随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离 出来，形成距原点不等的层析点。在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定

2、的移动速率（Rf值）Rf=原点到层析点中 心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时，如果只 用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近， 就不能将 它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。 这种方法称为双向层析法。本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪 氨酸、苯丙氨酸组成三、实验仪器1 、新华滤纸2、层析缸3、细线4、点样管5、橡皮筋6、电吹风7、喷雾器四、实验试剂1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸）2、 展层剂：正丁醇：12頰水：95临醇：蒸馏水=13： 3： 3： 1

3、（v:v）3、0.5%茚三酮一无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙 酮，贮于棕色瓶中五、实验步骤1、取滤纸剪成20 X 10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端23cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。2、取毛细管一支（回收），吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm每点一次用吹风机吹干，点23次为佳。3 、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端 12cm处时，停止展层（大约23小时）。4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘 箱60C）烘干。5、均匀喷上茚三酮一无水丙酮液，注意

4、使溶液不倒流，不间 断。6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基酸种类。（书上图谱横着看）六. 实验结果j从左到右依次为 H、H1、H2、H3 H4。H1=1.0cm H2=4.4cm H3=5.0cm H4=0.99cm H=11.7cm由此可得Rf1=0.08547Rf2=0.37607Rf3=0.42735Rf4=0.08461据此可知，混合氨基酸是由甘氨酸（Gly）和苯丙氨酸（Phy）组 成。七. 实验分析实验中出现了拖尾的现象。拖尾现象是指展层，显色后在层析分配图上，所看到的某一种氨 基酸的分子位移，不是如

5、标准图谱所示的那样，完整地显示在某一位 置上，而是形成象笤帚似的那样，前端粗圆而逐渐细小下来，宛如拖 着一个尾巴。其图所呈颜色也是由浓渐淡。图象的出现，是在实验中对影响 Rf值的主要因素要求，掌握不 够所致。诸如，物质结构与极性对Rf值的影响，层析溶剂对Rf值的 影响，PH对Rf值的影响（溶剂、滤纸和样品的PH值），温度对Rf值 的影响，滤纸的质地是否均匀，薄厚是否适当，纤维的松紧度是否适 中等对Rf值的影响，展层的方式（上行、下行）对Rf值的影响。然而 在多次实验过程中无论怎佯严格遵循其影响Rf值的主要因素的要求，都仍不可避免地要出现拖尾现象。此时，这就需要从具体操作规 范方面，诸如样品的处

6、理，点样、展层、显色等几个操作程序去考虑 思索，经仔细分析，样品的处理是为除去杂质纯化样品，达到层析分 配某氨基酸的情晰显色图像；展层过程是在上述影响Rf值的主要因素要求下进行，使样品达到一个适当的位移，便于在显色后从图象上, 区分不同样品的氨基酸；显色是在用配制好的，与水不相混合，并挥 发性较快喷雾后迅速吹干的。更何况显色剂又是含水量极低，不会影 响洋品的斑点扩散，那么问题就集中在点样这个操作程序上了。 点样 是将被层析分配的几种氨基酸混合液， 和为了对照实验结果，而分别 配制的几种氨基酸的溶液，用微量点样管或毛细管，或血球计数器将 5 一 j5微升的样品，点在以滤纸为惰性支持物的层析纸上设

7、计好的 多点位置中去。点样后要自然风干，或冷风吹干。最好不要用加热装 置，如吹风机，灯泡之类的热源将其样品点加速干燥。因为加热装置 在学生操作时，一但注意不够，掌握不好，则温度升高势必要使样品 破坏，更会使佯品点干的太燥。正是由于这样，样品点太干燥，使其 样品物的分子，牢固地吸牢在层析纸的纤维上。所以在展层过程中， 样品点的每个物质分子，不能在层析纸上同时起步，而是形成了有先 有后，鱼贯而上行或下行的状况，最终使洋品物质的分子，不能同时 都集中到达一个位置。致使在显色后，实验结果的图象上，观察到的 不是一个完整的斑点，而是一个拖着尾巴的斑点。这就是上述所说的 拖尾现象。纸上分配层析所出现的拖尾

8、现象， 究其原因很简单，就是在点样 品后，样品点吹的太干燥所致。样品点不要吹的太干燥，否则，样品 物质的分子，会牢吸在层析纸的纤维上，出现拖尾现象”。影响Rf值的主要因素1. 物质结构对于Rf值的影响：“物以类聚”，极性物质易溶于 极性溶剂（水）中，非极性物质易溶于非极性溶剂（有机溶剂）中。 所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸。所以前者在水（固定相）中分配较多，因此Rf值低于后者。2. 溶质与溶剂间的相互作用对 Rf值的影响：这种影响是由溶质与溶剂间的相互作用与分配系数的关系所决定的。溶质与溶剂之间若能形成氢键，对分配系数的影响就很

9、大。例如酚、三甲基吡 啶、氨等和水混合后都能很好地与溶质形成氢键。某些溶剂（例如酚，正丁醇等）是质子的供给体，而水既是质子的供给体又是 质子的接受体。当溶质结构中增加能接受质子的基团 （例如NH 2 ）时，因酚与水都能给NH 2基提供质子，所以酚和水两相对 接受质子的基团的引力，基本上是一致的，因此当溶质结构中增 加氨基时，该物质与酚和水的作用对其在酚和水两相间的分配影 响不大，对Rf值影响较小。又例如当有机溶剂是质子的接受体（如三甲基吡啶，NH3等），而溶质也是质子的接受体（如-NH 2 基），这时有机溶剂对-NH 2没有引力，而水却有引力，于是水 的引力就大于有机溶剂，因此溶质就被水拉向水

10、相，对Rf值的影响就大。3. pH对Rf值的影响：这种影响主要是由pH与分配系数的关系 所决定的。弱酸与弱碱的解离度受 pH影响很大，解离度越大， 极性越强，极性强的物质在两相溶剂中分配时， 偏向于极性强的一相，这样，改变pH就会同时改变分配系数，从而使 Rf也会相 应变化。在氨基酸的层析法中，改变溶剂的pH,使酸性和碱性氨基酸的Rf值变动较大，而中性氨基酸的Rf值变动较小。在正 丁醇中加甲酸，可使酸性氨基酸的极性降低，从而使Rf值变大, 而使碱性氨基酸的Rf变小。反之，如在正丁醇中加氨，可使天 冬氨酸和谷氨酸的Rf值变小，而使赖氨酸、精氨酸等碱性氨基 酸的Rf值变大。4. 滤纸对Rf值的影响

11、：滤纸本身的pH及含水量对Rf值的影响很大，所以不同的滤纸得到不同的 Rf值及不同的斑点形状。纸 上含水量的多少随溶剂与纸对水的亲和力的大小而异，质地不均一的滤纸常使溶剂扩展不一致，随着纤维的纹理流动紊乱，另一 方面纸的含水量不均一，也不能得到理想的分离效果。5. 温度对Rf值的影响：Rf值的重现性与恒温情况的好坏有密 切关系。温度对Rf值的影响主要是因为溶质在固体相与流动相 之间的分配随温度的变化而不同。随各溶剂组分的粘度和表面张 力的不同其蒸发能力也不同，因此有些溶剂系统对温度的敏感程 度强些，有些则差些。敏感程度强的对温度的要求就严格，敏感 程度差的对温度的要求就不太严格。温度改变使溶剂系统中的溶 解度改变，所以Rf值也改变。一般层析展层是在恒温室中进行 的，室温可在20C至40C，温度改变不超过士 0.5 C。无色物质的层析图谱可用光谱法（如核苷酸类物质用紫外光照射）或显色法鉴定。氨基酸纸上层析图谱常用的显色剂有茚三酮、吲哚醌。本实验采用茚三酮为显色剂。茚三酮显色反应受温度、pH,时间影响较大。如果要使结果重复，必须严格控制上述条件。 样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不显出颜色。 样品中含大量盐 时显色点上会出现白斑，