基质细胞衍生因子-1α及其受体CXCR4在急性白血病的表达及与髓外浸润的关系

1、基质细胞衍生因子-1及其受体CXCR4在急性白血病的表达及与髓外浸润的关系         08-03-10 14:38:00     作者：刘峥嵘，孙慧，邹萍    编辑：studa20【摘要】  为了探讨基质细胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）及其受体CXCR4在急性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞三系白血病的表达及与髓外浸润的关系，对66例急性白血病中的急性淋巴细胞白血病（

2、ALL）患者组（31例）、急性粒细胞白血病（M2）患者组（20例）、急性单核系细胞白血病（M4+M5）患者组（15例）、髓外浸润患者组（41例）、非髓外浸润患者组（25例），应用酶联免疫吸附实验（ELISA）及流式细胞术分别检测SDF-1及其受体CXCR4在三组白血病外周血及骨髓白血病细胞上的表达。结果表明：ALL患者组、M4+M5患者组、M2患者组及正常对照组血浆的SDF-1水平分别为1317.87±220.76，1339.79±187.06，1063.70±190.74，1908.34±135.55 (pg/ml)，其中ALL患者和M4+M5患者组高

3、于M2患者组，但均明显低于正常对照组（P0.01）。髓外浸润患者组及非髓外浸润患者组SDF-1血浆水平分别为1252.49±263.12、1234.91±185.50，（pg/ml），组间无显著差别。CXCR4在ALL患者组、M4+M5患者组、M2患者组白血病细胞上表达的平均荧光强度（MFI）为78.47±33.96、67.21±24.29、41.66±17.18，ALL患者组及M4+M5患者组明显高于M2患者组（P0.05）。ALL患者组、M4+M5患者组间无显著性差别。髓外浸润患者组CXCR4表达的MFI（81.72±27.63）

4、明显高于非髓外浸润患者组（36.94±11.86）（P0.05）。结论：急性淋巴细胞、单核细胞系白血病细胞趋化因子受体CXCR4高表达可能是其易发生髓外浸润的分子机制，3组白血病患者外周血SDF-1表达水平均降低且与髓外浸润无明显相关，髓外浸润可能更取决于受浸润脏器局部SDF-1表达水平。 【关键词】  急性淋巴细胞白血病Expression of SDF-1 and Its Receptor CXCR4 in Acute Leukemias and  Their  Relationship with Extramedullary Infiltratio

5、nAbstract    The study was aimed to explore the expression of stromal cell derived factor-1(SDF-1) and its receptor CXCR4，and their relationship with  the extramedullary infiltration in acute lymphoblastic，grannulocytic and monocytic leukemia. 66 cases of acute leukemia included

6、31 cases of acute lymphoblatic leukemia (ALL)，20 cases of acute grannulocytic leukemia (M2) and 15 cases of acute monocytic leukemia (M4+M5). There were 41 cases with extramedullary infiltration  and 25 cases without-extramedullary infiltration.  Enzyme-linked immunoabsorbent  assay&#

7、160; (ELISA) and flow cytometry were used to determine expression of SDF-1  and CXCR4 respectively   on  leukemia cells in peripheral blood and bone marrow of different groups. The results showed that average plasma level of SDF-1 in the ALL，M4+M5，M2 patients  and the normal

8、 control  were  1317.87±220.76，1339.79±187.06，1063.70±190.74，1908.34±135.55  （pg/ml）   respectively. The average levels in the ALL，M4+M5 and M2  patients groups were lower than those in normal control group. Both levels in ALL and M4+M5  patient

9、 groups   were higher than that in M2 patient group. The average levels of SDF-1 in patient group  with extramedullary infiltration  and patient groups  without-extramedullary infiltration  were 1252.49±263.12，1234.91±185.50 （pg/ml）  respectively. The for

10、mer seemed  as if higher than the latter，but without statistical significance. The MFI of CXCR4 expression in ALL，M4+M5，M2  patient group  were 78.47±33.96，67.21±24.29，41.66±17.18，  respectively. CXCR4 expression in ALL and M4+M5 patient  groups were higher th

11、an that in M2 patient group   (P0.05). There was no significant difference between the ALL  and  M4+M5  patient group    (P>0.05). The MFI of CXCR4 expression  in patients with extramedullary  infiltration  and patients without  extra-me

12、dullary   infiltration  were 81.72±27.63，36.94±11.86 respectivehy.  The former  was higher than the latter(P<005). It is concluded that the higher expression of CXCR4 on acute lymphoblatic and monocytic   leukemia cells may be one of the molecular mech

13、anisams of extramedullary infiltration in both kinds of leukemia.  The average plasma levels of SDF-1 decreased in leukemia patients and this decrease not related to the extramedular infiltration，which may be due to the SDF-1 local expression in the organ infiltrated.Key words  acute 

14、 lymphoblastic leukemia；acute grannulocytic leukemia；acute monocytic leukemia；stromal cell derived factor-1；CXCR4；extramedullary infiltration    白血病是恶性克隆性疾病，广泛浸润骨髓、肝、脾及淋巴结等器官。尽管Reiter等1报道外周血白血病细胞数量反映体内白血病细胞负荷的多少，与髓外浸润的严重程度相关，但其具体机制并不清楚。白血病髓外浸润是一个复杂的病理过程，包括白血病细胞的趋化、黏附、迁移、异位器官侵袭、生存、增殖及抗

15、凋亡等多个环节。有关白血病细胞上黏附因子受体的表达与髓外浸润的研究较多2，3，而对髓外浸润与趋化因子及其受体的表达的关系国内尚未见报道。基质细胞衍生因子-1（stromal cell  derived factor -1，SDF-1）是首先发现于骨髓基质细胞培养上清的趋化性细胞因子，其受体CXCR4为G蛋白偶联受体，属于趋化因子亚家族CXC成员之一，二者特异结合，参与造血生成、胚胎造血迁移、胚胎发育、组织再生、塑造、伤口愈合及肿瘤细胞的转移和恶化等一系列生理、病理过程的调节。我们应用流式细胞术检测白血病细胞表面的趋化因子及其受体CXCR4的表达，并探讨二者与髓外浸润的关系。材料和方法

16、病例选择和分组所有病例取自本院血液科门诊及住院的初治急性白血病患者，66例，分组如下。    依据1986年FAB制定的MIC分型标准划分为：急性淋巴细胞白血病（ALL）31例，其中男20例，女11例，平均年龄23.71±19.28岁，L1 1例，L2 29例，L3 1例；急性非淋巴细胞白血病（单核细胞系M4+M5）15例，男9例，女6例，平均年龄39.67±17.52岁，M4  4例，M5 11例；急性非淋巴细胞白血病（粒细胞系M2）20例，男12例，女8例，平均年龄31.86±13.25岁。  

17、60; 依据髓外浸润的症状分为髓外浸润组和非髓外浸润组。髓外浸润的判断：体检及B超检查出现下列体症之一即为髓外浸润组：皮肤结节（病理证实为白血病细胞浸润），牙龈增生，肝、脾、淋巴结肿大，中枢神经系统浸润。本研究66例患者中髓外浸润41例，男18例，女23例，平均年龄28.74±19.16岁；其中ALL 23例，M2 7例，M4+M5 11例。非髓外浸润25例，男14例，女11例，平均年龄32.13±17.35岁；其中ALL  8例，M2 13例，M4+M5 4例。    正常对照组10例，男6 例，女4例，平均年龄35.0±

18、12.0 岁。仪器试剂FACSort流式细胞仪（Becton Dickinson公司产品），SVNRISR全自动酶标仪（澳大利亚Ges.M.B.H.TECAN公司产品）。4520 S/N17918-455摇床（美国Forma Scientific InC公司产品），Biofuge Stratus，Heraeus台式高速低温离心机（德国贝克曼公司产品）。-80冰箱（日本Sanyo产品）。-20冰箱（新飞公司产品）。CD2、CD7、CD19、CD20、CD38、CD33、CD34、CD117单克隆体抗为Becton Dickinson公司产品，TdT、CD5、CD10、CD13、CD14、CD64

19、单克隆抗体均为PharMingen公司产品，PE标记CXCR4单克隆抗体及小鼠同型Ig2对照购自R&D公司。SDF-1酶联免疫吸附实验试剂盒（购自R&D公司，灵敏度为18 pg/ml）包括：覆盖SDF-1单克隆抗体96孔板，SDF-1结合液21 ml，SDF-1标准品100 ng，检测稀释液RD1-55 11 ml，校正稀释液RD6Q  21 ml，显色剂A 12.5  ml，显色剂B 12.5 ml，停止反应液6 ml，清洗缓冲液20 ml，胶带4张。淋巴细胞分离液，小牛血清白蛋白（BSA），叠氮钠，肝素钠（12 500 U），Dubicol缓冲液。CXC

20、R4的检测采用双色荧光标记法，以新鲜骨髓标本常规白血病免疫分型，同样标本以淋巴细胞分离液梯度密度离心获单个核细胞，以预冷的含0.5%的BSA、0.1%叠氮钠的PBS(Dubicol)洗2次（1 000转/5分钟）。调细胞浓度至4×106/L，取上述细胞悬液50 l，分别加入PE标记的CXCR4单克隆抗体和小鼠Ig2同型对照。4冰箱内放置40分钟，以PBS(Dubicol)离心洗去多余未结合的抗体，加入400 l  PBS 上机检测。各测定管用FACSort流式细胞仪CellQuest软件以对数（log）取样，每管获取并分析10 000个细胞。通过前向角光散射（forward

21、 scatter，FSC）和侧向角散射（side scatter，SSC）设门（R1），以排除碎片和死细胞。再用CD45/SSC设门分析R1内细胞，依据细胞的抗原表达及细胞的颗粒性识别各群细胞。判别正常细胞与异常细胞群进行重点分析。依据CellQuest软件32分析细胞表面的MFI。     SDF-1检测血浆标本的收集和处理  收集骨髓标本同时取肝素抗凝的外周静脉血1.5 ml，30 分钟内离心，1 000×g离心15分钟，取上层血浆在-4条件下以10 000×g进行第2次离心10分钟，留取上层血浆置-80冰箱冻

22、存。正常对照组取自门诊检查并排除恶性血液病的就诊者外周静脉血（肝素抗凝）1.5 ml，标本处理方法同上。血浆SDF-1浓度的酶联免疫吸附检测 主要步骤如下：复温：将所有试剂及标本温度恢复至室温；标准曲线的制作：取试管8个，分别编号1-8，于1管中加入900 l校正稀释液，2-8管分别加入500 l校正稀释液。将1ml三蒸馏水加入100 ng  SDF-1标准品中，充分混匀，终浓度为100  000 pg/ml，取100 l上述浓度标准品加1管中，混匀后以移液枪吸取500 l移入2管，再次混匀，依次移入3-7中，8为空白对照管；于ELISA微孔板中每孔加检测RD1-55稀释液100 l；每孔加标准品或样本100 l，混匀，以胶带封闭，固定至摇床上（500 ±50 rpm）室温下孵育2小时； 配制清洗缓冲液：以量筒量取480 ml蒸馏水，以吸管加入浓缩稀释液20 ml至500 ml，玻棒混匀待用；每孔加入400 l上述清洗缓冲液，混匀，弃去液体，以洗水纸吸干，重复洗4次；每孔加200 l  SDF-1结合液，以胶带覆盖，重复放置摇床上孵育2小时；每孔加入400  l上述清洗缓冲液，4次；配制底物作用液：取A液、B液等量混匀于小烧杯