HAb25肝癌单克隆抗体可变区基因的克隆和序列测定

1、    HAb25肝癌单克隆抗体可变区基因的克隆和序列测定        【摘要】目的克隆HAb25肝癌单克隆抗体(McAb)的可变区基因。方法RT-PCR法从分泌HAb25单克隆抗体的杂交瘤细胞中，扩增出VH和VL基因，双脱氧链终止法测定其核苷酸序列。结果VH和VL基因的两端均含有完整的引物序列，VH基因全长360bp，编码120个氨基酸，VL基因全长330bp, 编码110个氨基酸，重、轻链可变区内均仅含单一开放读框，具有明显的抗体可变区特征，与基因数据库(GenBank

2、)中的序列进行比较分析，基因库中无相同的基因，VH基因与小鼠重链VH186.2家族同源性最高(84.00%)，属小鼠Ig重链可变区9个家族中的第三族，VL基因与小鼠kappa轻链MMIgGKAVAG基因同源性最高(82.00%)，属小鼠Ig kappa轻链第组。结论克隆的HAb25 McAb的可变区基因为功能性重排的小鼠可变区基因。【关键词】癌，肝细胞抗体，单克隆基因克隆Cloning and sequencing of variable region genes of HAb25 McAb against hepatocellular carcinomaHU Chuanmin, LIU Ya

3、nfang, GAO Lei, et al.Department of Pathology, The Forth Military Medical University, Xian 710032【Abstract】 Objective To clone the variable genes of HAb25 McAb against hepatocellular carcinoma. Methods The HAb25 variable region genes were isolated by RT-PCR technique from the HAb25 hybridoma, and it

4、s nucleic acid sequences were analyzed by the sangers dideoxy-mediated chain-termination method. Results The gene of VH was 360bp long encoding 120 amino acids and the gene of VL was 330bp long encoding 110 amino acids. Only one open reading frame could be found in each of the variable genes. A comp

5、arison of the sequences of VH and VL domatins derived from the HAb25 antibody with those of the published mouse Ig genes in GenBank by computer revealed that the VH gene was homologous to the VH186.2 germline gene family (84.00%) and VL gene was homologous to the MMIgGKAVAG(82.00%). Conclusion Both

6、of the two genes are rearranged variable region genes, which are VHDJH3 for the VH and VK J K4 for the VL.【Key words】 Carcinoma, hepatocellular McAb Genes Clone鼠源性HAb25肝癌单克隆抗体(McAb)与肝癌组织结合的阳性率高(83.15%)，仅与少数肝硬化和肝外肿瘤存在弱的交叉反应，131I标记HAb25在荷肝癌裸鼠和肝癌患者体内具有显像时间短、定位准确的特点，与阿霉素化学交联制备的免疫结合物对体内外的肝癌细胞有明显的导向杀伤活性，显

7、示出良好的临床应用前景1。有必要对其实施基因工程改造，提高其临床应用价值。构建基因工程抗体的首要问题是克隆出目的抗体的可变区基因2。经RT-PCR方法从HAb25杂交瘤细胞中扩增出抗体的可变区(VH、VL)基因，序列分析证实所克隆的可变区基因是重排的IgV区基因，为进一步的小分子抗体表达和蛋白质工程改造奠定了基础。材料与方法1.引物合成：用于扩增抗体可变区的两对引物，VHBACK: 5TTCTATGCGGCCCAGCAGGCC ATGGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG3; VHFOR: 5ATACGAGCTCTGAGGAGACGGT GACCAGGGTGCC3; VLBACK: 5

8、CCAGATGTG AGCTCGTGACCCAGACTCCA3; VLFOR: 5CC GTCGACACGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC3。 VL和VH引物中分别引入Bg1/sa1和Sfi/Sac酶切位点，由中国科学研究院上海生化所合成。2.杂交瘤细胞总RNA的提取： 取生长良好的约1×108HAb25杂交瘤细胞，采用异硫氰胍一步法提取细胞总RNA。3.cDNA第一链的合成：取上述细胞总RNA4l(16g 总RNA)，分别加入5×第一链缓冲液4l, RNase抑制物(RNasin) 1l, Oligo(dT)15引物2l, 5mmol/L dNTP 2l, 总反

9、应体积20l, 42水浴中反应90分钟。4.PCR扩增反应：0.5ml的Eppendorf管中依次加入上述cDNA第一链产物2l, VHBACK, VHFOR或VLBACK, VLFOR引物各2l(100mol/L,10×PCR缓冲液5l, 2.5mmol/L dNTP 4l, 加H2O 33l, 使反应总体积至50l, 95变性60秒，55退火60秒, 35个循环和72保温10分钟后，取8l反应产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳观察结果。5.PCR扩增产物VH、VL的定向克隆：VL PCR扩增产物经Klenow酶补平和Bg1/Sa1酶切后，克隆入BammH/Sa1酶切的pUC19质粒载体

10、上：VH PCR扩增产物经Klenow酶补平和Sac酶切后，定向克隆入Sma1/Sac酶切的pUC19质粒载体。EcoR/sa1双酶切鉴定阳性重组子。6.VH、VL基因的核苷酸序列测定： 碱裂解法大量提取含VL/VH基因的阳性重组子质粒DNA，并经FPLC HiTrap Q柱纯化，紫外分光光度定量。按T7 Sequence Kit说明书进行序列测定。所读序列与GenBank中的序列进行比较。结果1.PCR扩增HAb25VL、VH基因：VH的扩增产物电泳中，约在360bp区域处可见一条较强的荧光带。在VL的扩增产物电泳中，约在330bp区域处可见一条较强荧光带。回收VH360bp和VL330bp

11、条带，作为第2轮PCR扩增的模板，再经30个PCR循环扩增后，得到一条清晰的VH360bp和一条清晰的VL330bp强荧光带。2.HAb25 VH和VL在pUC19质粒中的克隆和鉴定：将HAb25 VH和VL的PCR扩增产物酶切后与对应酶切线性化的pUC19质粒载体连接，转化JM109感受态细菌。经EcoR和Sa1双酶切鉴定。共获得5个HAb25 VH-pUC19重组克隆，4个HAb25-pUC19重组克隆。3.HAb25重链可变区基因序列分析：基因全长360bp, 编码120个氨基酸(1)，根据Kabat分类体系，HAb25 VH基因隶属于VH与JH3重排，小鼠重链第3D亚组，其特点是：序列

12、两端含有PCR引物序列及正确的酶切位点；含有维持抗体结构所必需的半胱氨酸，分别位于第22位和95位；序列内不含终止码。在GenBank中与IgV区已知序列的同源性比较，HAb25 VH基因与小鼠重链VH186.2家族同源性最高(84.00%)。横线示引物序列和三个CDR区1HAb25VH基因的核苷酸序列及其对应的氨基酸序列4.HAb25轻链可变区基因序列分析：基因全长330bp，编码110个氨基酸（2），根据Kabat分类体系，HAb25 VL基因隶属小鼠kappa轻链第组，其特点是：序列两端含有PCR引物序列及正确的酶切位点；含有维持抗体结构所必需的半胱氨酸，分别位于第20和90位；序列内不

13、含终止码。与GenBank中IgV区已知序列的同源性比较，HAb25基因与小鼠kappa轻链MMIgGKAVAG基因同源性最高(82.00%)。横线示引物序列和三个CDR区2HAb25VL基因的核苷酸序列及其对应的氨基酸序列讨论我们试过多种“通用”引物，只有用文中列出的引物，才经PT-PCR法从HAb25杂交瘤细胞中克隆出重排的可变区基因。说明利用PCR法克隆抗体的可变区基因的关键之一是寡核苷酸引物的设计，虽然抗体基因的FRI区和J区(3端)存在保守性，但抗体各亚类之间基因存在差异是明显的，尽管不少作者试设计一套“通用”引物，即计算机分析特定位置上出现何种碱基的概率而选择引物序列，并引入简并码

14、3,4，但实际结果却表明，这种“通用”性也仅能适用某几种亚组的抗体可变区基因的克隆。在引物设计中引入合适的酶切位点、起始码和终止码，使PCR产物更易克隆，获得的抗体V区基因片段也易进行诸如小抗体、单链抗体的克隆和表达。确是一种最简便，快速获得特异性IgV区基因的方法3。HAb25杂交瘤细胞生长稳定，连续转化多次仍保持较好的分泌抗体能力，这为克隆抗体的可变区基因，客观上提供了有利条件，互为独立2个VH和VL pUC19酶切阳性的重组克隆，其序更完全一致，根据Kabat资料及与GenBank中与IgV区已知序列的同源性比较，HAb25克隆的可变区基因有如下特点：序列两端含有PCR引物序列及正确的酶

15、切位点；各含有二个维持抗体结构所必需的半胱氨酸，且均位于框架区（FR1区， FR3区）；序列内不含终止码；VH基因隶属VH与JH3重排，与小鼠重链VH186.2家族同源性最高(8 4.00%), VL基因与小鼠kappa轻链MMIgGKAVAG基因同源性最高(82.00%)，属小鼠Ig kappa轻链第组。故我们认为克隆的HAb25可变区基因是重排的，具有功能的抗体IgV区基因，HAb25抗体可变区基因的克隆成功，为其进一步基因工程改造奠定了基础。作者简介：胡川闽男，34岁，博士，副教授作者单位：胡川闽刘彦仿（710032西安，第四军医大学病理学教研室）；高磊陈苏民陈南春（生化及分子生物学教研

16、室（胡川闽现在第三军医大学复合伤研究所工作）参考文献1 胡川闽，刘彦仿，叶恒光，等. HAb25肝癌单克隆在人体中的导向定位作用及其血药动力学. 单克隆抗体通讯，1995, 1: 10-15.2 Carter P,Merchant AM. Engineering antibodies for imaging and therpay. Curr Opin Biotechnol, 1997, 4: 449-454.3 Orlandi R, Gussow DH, Jones PT, et al. Cloning immunoglobulin variable domains for expressi

17、on by the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci, 1989, 86: 3833-3837.4 Cheedle C,Hook LE, Givol D, et al. Cloning and expression of variable regions of mouse protein MOPC315 in E. coli: recovery of Fv fragments. Mo1 Immunol, 1992, 29: 21-30.(本文编辑：何亚玲校对：袁平戈)(收稿：1998-04-27修回：1998-11-23)Correla

18、tion between hepatocyte cytochrome P450E1 expression and oxidation , antioxidation in rat nonalcoholic steatosis modelDAI Ning, ZENG Minde, LI Jiqiang, et al.Shanghai Institute of Digestive Disease, Renji Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001【Abstract】 Objective To study the

19、correlation between hepatocyte cytochrome P450E1(CYPE1) expression and oxidation, antioxidation in rat nonalcoholic steatosis model. Methods The expression of hepatocyte CYPE1 antigen in rat steatosis model induced by high fat diet was detected with immnohistochemistry. Meanwhile, MDA, SOD, GSH and

20、VitE contents in the liver were measured by biochemical analysis. Results Expression of CYPE1 in rat nonalcoholic steatosis by high fat diet was prominent in hepatic acinar zone 3, and had a more extensive acinar distribution from zone 3 to zone 2, MDA contents in fatty liver was significantly incre

21、ased than in normal, SOD, GSH and VitE contents were significantly deecreased than in normal. There were significant positive correlation between CYPE1 and MDA (P<0.01), and negative correlation between CYPE1 and SOD, GSH, VitE (P<0.05, P<0.05, P<0.01). Conclusions Hepatocyte CYPE1 expre

22、ssion in nonalcoholic steatosis is prominent in hepatic acinar zone 3. Its expression resembles alcoholic fatty liver. There is significant correlation between CYPE1 and lipid peroxidation.【Key words】 Fatty liver CytochromeP450 Lipid peroxidation Immunohistochemistry细胞色素P450E1(cytochrome P450E1, CYP

23、E1)是肝细胞微粒体乙醇氧化系统的主要成分，它在乙醇的代谢中起重要作用1。我们以高脂饲料诱发大鼠脂肪肝模型，用免疫组织化学的方法来观察非酒精性脂肪肝肝细胞CYPE1的表达情况，并研究其与氧化抗氧化的相互关系。材料与方法一、材料1. 实验动物：SD大鼠16只（清洁级），雄性，体重190210g，购自中国科学研究院上海动物实验中心。2. 主要试剂和仪器：兔抗鼠CYPE1多抗由瑞典Karolinsk研究所分子毒理学实验室Magnus Ingelman-Sundberg教授惠赠。链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组织化学染色试剂盒(SPKit)购自福州迈新生物技术公司。丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(

24、SOD)、谷胱甘肽(GSH)、维生素E(VitE)试剂盒购自南京建成生物公司。FR-980生物象分析系统由上海复日生物实验技术研究所生产。二、方法1. 动物分组和模型的建立： SD大鼠正常喂养1周后随机分为2组，每组8只，组为正常饮食对照组，组为高脂饮食组(基础饲料88%, 猪油10%, 胆固醇1.5%, 胆盐0.5%)，实验动物自由饮水进食，饲养于1822明暗各12小时的清洁级动物实验室内，造模时间为8周，8周后处死全部动物，取肝活组织分别做肝匀浆和石蜡切片待检。2. 肝匀浆的生化测定：取肝右叶1g, 4下制成10%的肝匀浆，分别测定MDA和SOD、GSH、VitE，结果以每克肝湿组织的含量

25、表示。按试剂盒说明书操作。3. 病理学检查：取肝左叶，体积分数10%甲醛固定，常规HE染色，观察脂肪肝的程度。CYPE1免疫组织化学染色，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组织化学法(SP法)，DAB显色，一抗CYPE1多抗的工作浓度为1:400，操作流程按试剂盒说明书进行，每次试验均设阴性对照，以PBS替代一抗。CYPE1的表达程度及范围通过生物象分析系统换算成显色指数进行定量分析。4. 统计方法：组间比较采用两样本均数的t检验，各指标之间的相关性采用两因素的相关分析。结果一、肝组织病理学变化1. 光镜下HE染色显示，组动物肝组织的形态学表现正常，组所有动物肝组织均出现了中度以上的肝细胞脂

26、肪变性，肝细胞变大，胞浆内的脂滴多为大泡形，腺泡3区的脂肪变性相对较重。2. 光镜下肝细胞CYPE1的免疫组织化学染色显示：组的肝CYPE1的表达局限在腺泡3区中央静脉周围少数几个肝细胞内，不超过23个细胞层的厚度。而组动物的肝CYPE1的表达则呈现弥散性的分布，从腺泡3区弥散至2区，CYPE1的分布与肝细胞脂变的分布相一致。阴性对照未见着色。CYPE1的表达程度及范围通过像分析系统换算成显色指数，组的显色指数为0，组的显色指数为0.24±0.03，二者相比差异有显著性(P<0.05)。二、肝内MDA、SOD、GSH和VitE含量的变化组与组相比，MDA的含量显著上升，SOD、

27、GSH和VitE则显著下降，见表1。表1肝内MDA、SOD、GSH和VitE含量的变化(±s)组别动物数（只）MDA(nmol)SOD(NU)GSH(mg)VitE(mg)8174.69±16.4511.57±0.9353.60±12.6458.98±10.378210.15±14.59*4.38±2.86*34.12±14.80*35.88±13.80*每克肝湿重，组与组相比，*P<0.05, *P<0.0 三、脂肪肝肝CYPE1显色指数与MDA、SOD、GSH和VitE之间的相关性相关分析

28、表明，CYPE1显色指数与MDA的含量呈正相关(r=0.9167, P<0.01)，而CYPE1显色指数与SOD、GSH和VitE分别呈负相关(r值分别为-0.7556, -0.7543, -0.8470, P值分别小于0.05, 0.05, 0.01)。讨论我们的实验结果与胆碱缺乏性脂肪肝以及酒精性脂肪肝的CYPE1的表达相似2，即在腺泡3区表达增强，并从3区弥散至2区。体内外的研究证实，酒精性脂肪肝微粒体CYPE1表达的增强与自由基的生成增多有关，我们的相关分析也表明，CYPE1的表达增强与脂质过氧化的终产物有非常显著的正相关。Ekstrom3证实，大鼠微粒体氧类的生成与CYPE1有

29、量效关系，而且用电子自旋扑集技术证实，羟自由基的产生也与CYPE1的表达有关4。羟自由基是脂质过氧化反应的启动剂，随着CYPE1表达的增强，脂质过氧化反应的加剧，其终产物MDA的含量也升高。我们的相关分析表明，随着CYPE1表达增强，SOD、GSH、VitE的含量显著性下降。由于过氧化反应的增强而抗氧化能力的下降，从而使自由基的生成增多。自由基不但氧化细胞膜的脂质，更重要的是氧化细胞膜的蛋白质，最终导致肝细胞结构与功能的损害5。由于高脂饲料的摄入增加了肝细胞微粒体CYPE1的表达，且与酒精性脂肪肝的表达相类似，我们的实验也证实CYPE1在非酒精性脂肪肝介导了相似的过成，产生了多种有害的自由基。由此推测，非酒精性脂肪肝与酒精性脂肪肝可能有共同的病理机制。本课题受国家自然科学基金资助（No.39670339）作者简介：戴宁男，35岁，博士，发表论文10余篇作者单位：戴宁曾民德李继强范竹萍茅益民彭延申邱德凯（200001