HLA-DR4基因亚型在骨髓移植中的应用研究

1、HLA-DR4基因亚型在骨髓移植中的应用研究骨髓移植供、受体的HLA相合程度是决定移植成败的关键因素之一。HLA-DR4亚型在各人种中的频率均较高，且与骨髓移植后GVHD(graft-versus-host disease,移植物抗宿主病)的发生有关1-3。为探讨HLA-DR4基因亚型在骨髓移植中的意义，设计合成了HLA-DR4等位基因引物4，建立巢式PCR-SSP分型方法，并对75例临床标本进行了分析。 材料与方法研究对象：来我院拟进行骨髓移植的患者及其家属，其中正常无血缘关系个体41例，患者34例，包括1例无血缘关系的供、受体。引物合成：根据文献4，由军事医学科学院二所合成。其它试剂：DN

2、A聚合酶及dNTPs为Promega公司产品，PCR循环仪为PE-9700。方法1.盐析法提取人外周血DNA5。2.巢式PCR-SSP操作方法(1)扩增HLA-DRB1的第二外显子：管中加入人生长因子引物作为内对照。PCR反应体系为：基因组DNA0.10.5ng,1PCR buffer,dNTPs 0.4mmol/L,MgCl2 4mmol/L，DRB1第二外显子引物对20pmol，人生长因子引物对6.7pmol,DNA聚合酶1U，加去离子水至20l。循环参数：30个循环，94 20秒，65 50秒，72 20秒；72 7分钟。(2)扩增DR4亚型：每个样品扩增12管，111管为DR4特异性扩

3、增管，第12管为阴性对照管，每管均加入生长因子引物作为内对照。PCR反应体系为：取DRB1第二外显子扩增产物10-5作为模板，1PCR buffer,dNTPs 0.4mmol/L,MgCl2 4mmol/L,DR4 亚型引物对20pmol/L,人生长因子引物对6.7pmol,DNA聚合酶1U，加去离子水至20l。循环参数：22个循环，94 20秒，66 30秒，72 20秒；72 7分钟。阴性对照管为在上述体系中用水代替模板。(3)将扩增产物加样到含0.5%溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳，140V 10分钟，紫外灯下观察结果。3.MLR实验：参见文献6。结果与讨论1.检测到的8种HLA-DR

4、4亚型及其频率：对75例骨髓移植供、受体进行HLA-DR4亚型的巢式PCR-SSP分析，共检测到8个HLA-DR4亚型，即HLA-DRB1*0401、0402、0403、0404、0405、0406、0410、0411。对该群体中随机选择的41例无血缘关系的正常供髓者进行了基因频率分析，结果发现上述DR4亚型的基因频率依次为：0.10、0.02、0.12、0.05、0.39、0.27、0.07、0.02，其中HLA-DRB1*0405频率最高，为0.39。本实验理论上共可分到18个DR4亚型，到目前为止仅分到8个，可见这8个亚型是中国人中常见的HLA-DR4基因亚型。这为中国人群筛选无关供体提

5、供了初步资料。2.4例特殊的骨髓移植供、受体分型结果：本实验中共有4例特殊的骨髓移植供、受体：第1例供、受体为母子关系，血清学分型结果均为DR4阳性，经DR4亚型分析发现该受体为DRB1*0405，其母亲为DRB1*0406；第2例供、受体为无关供、受体，血清学分型结果为HLA、类型别完全相合，而且为HLA-DR4阳性。经DR4亚型分析发现该受体为DRB1*0405，供体为DRB1*0401。对该病例进行的MLR实验表明：刺激指数(SI)=7.5，移植物抗宿主(GVH)的发病风险(RR%)=16.6%。可见体内发生GVHD的风险是很高的。第3、4例经血清学分型为DR4表型纯合，用巢式PCR-S

6、SP进行分型发现其中1例为0403与0410的等位基因杂合体，另一例为0405与0411的等位基因杂合体。3.HLA-DR4基因亚型在各种白血病中的分布：HLA-DR4基因亚型在各种白血病中的分布见表1。从表1中可以看出，0405在白血病中的频率最高，为0.42。将0405在正常无血缘关系人群中的频率与白血病人群中的频率进行了统计学分析，结果0.05P0.5，故0405在这两种人群中频率分布无统计学差别，0405与白血病之间并无内在联系。表1HLA-DR4基因亚型在各种白血病中的分布HLA-DR4等位基因白血病类别AMLCMLALLNALLMDSNHLMM0404201000104020000

7、000040302001000404110000004053602220040634100100410010100004110100000有文献报道1例无关供、受体骨髓移植，供者DR4亚型为0401，受体为0404，其余位点均相合，骨髓移植后病人发生了级GVHD反应，并于移植后85天死亡2。本实验所做的1例无关供、受体骨髓移植配型，经DR4亚型分析发现供体为0401，而受体为0405，从氨基酸序列来看这两个亚型在1功能区的第67和71位均有两个氨基酸的差别，这两个氨基酸是MHC结合抗原的关键部位。对该病例进行的MLR实验表明：SI=7.5，GVH的RR%=16.6%，预测发生GVHD的风险很高

8、。这说明巢式PCR-SSP分辨率较高，在无血缘关系供、受体移植中可提供准确的配型资料，以减少GVHD的发生，提高移植成功率。HLA-DR4亚型的巢式PCR-SSP分型方法对于相关骨髓移植配型同样具有重要意义。如1例供、受体为母子关系，血清学分型为DR4，当进行巢式PCR-SSP分析时发现母亲为0406，儿子为0405。这说明孩子的DR4来自父亲。又如对两例0403与0410和0405与0411的等位基因杂合体的正确分型，这充分说明即使在同一家庭内，也要做DR4亚型分型，尤其在中国独生子女较多的情况下，亲子之间的配型也逐渐增多，巢式PCR-SSP分型方法在确保HLA配型正确性方面具有独特的意义。

9、HLA-DR4亚型的巢式PCR-SSP分型方法分辨率高、特异性强，可为临床骨髓移植及基础研究提供科学依据，尤其对疑难病例及无关供、受体骨髓移植有重要意义。 作者单位：100850 北京，军事医学科学院附属医院参考文献1Holmes JA,Whittaker JA. Histocompatibility antigen DR4 is associated with chronic grafr-versus-host disease in the south Wales population.Br J Haematol,1989,73?424.2Yamanaka K,Kwok WW,Mickels

10、on EM,et al.Selective T-cell-receptor gene usage in allorecognition and graft-versus-host disease.Transplantation,1993,55?1167-1175.3Erik Thorsby.Invited anniversary review:HLA associated diseases.Hum Immunol,1997,53?1-11.4Savelkoul PHM,de Bruyn-Geraets DP,van den Berg-Loonen EM,et al.High resolution HLA-DRB1 SSP typing for cadaveric don