凝胶迁移或电泳迁移率试验EMSA

1、1）什么是凝胶迁移或电泳迁移率实验？凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA 是一种研究 DNA 结合蛋白和其相关的DNA 结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA 结合蛋白，目前已用于研究RNA 结合蛋白和特定的 RNA 序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P 同位素标记的 DNA 或 RNA 探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或 RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类 的 DNA 结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或

2、核细胞抽提液。在检测RNA 结合蛋白时，依据目的 RNA 结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实 验中采用含蛋白结合序列的DNA 或 RNA 片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定 DNA 或 RNA 结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的 特点和强度来确定特异结合。2）作这样的实验需要什么试剂？凝胶迁移实验需要的结合蛋白，可来源于纯化或部分纯化的蛋白，或粗的核和胞质抽提液。还必须制备同位素标记的 DNA 或 RNA 一般，DNA 核苷酸探针用 g-32P 和 T4 多核苷酸激酶来作末端标 记，同位素标记的

3、RNA 用噬菌体 RNA 聚合酶和同位素标记的核苷酸在体外合成。Promega 公司的Riboprobe?/sup 系统（a,b）（目录号 P1420，P1430， P1440， P1450， P1460）可用于同位素标记 的 RNA 的体外合成，DNA5末端标记系统（目录号 U2010）用于制备 DNA 探针，结合反应所需的组 分有：含盐的溶液（氯化镁，氯化钠，或氯化钾）、缓冲体系（Tris-HCl 或 HEPES、还原剂（DTT、 甘油、非特异的竞争 DNA（poly（dl:dC）?dl:dC），也可能含非离子去污剂。在结合蛋白和同位素标记的探针作用后，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合

4、物，随后将凝胶干燥并放射自显影， 或用Phosphorlmage?/sup 分析。3）凝胶迁移实验系统提供了什么试剂？Promega 公司提供一种凝胶迁移实验系统检测DNA 结合蛋白，系统可作为这类实验的一种正对照。系统包括目的寡核苷酸，对照DNA 结合蛋白，结合缓冲液，用于寡核苷酸探针末端标记所需的试剂。Core 系统（目录号 E3050）包括含重组 AP2 蛋白（AP2 抽提液）的大肠杆菌抽提液和AP2 的同源寡核苷酸。AP2 抽提液是从表达 AP2 蛋白的大肠杆菌中提取的。另外， Core 系统还含 SP1 同源寡 核苷酸，凝胶迁移结合缓冲液（5），和能作 20 次对照实验的 HeLa

5、核抽提液。Complete 系统（目 录号 E3300）含另外 5 个双链寡核苷酸，分别是AP1、OCT1 CREB,、NF-kB、TFIID 结合位点的同源序列。这些寡核苷酸可以在末端标记后用作特异性探针，或在竞争实验中用作非特异性探针。参考凝胶迁移实验技术手册TB110 获取更多的资料。4）成功进行凝胶迁移实验，需要优化哪些因素？凝胶迁移实验在理论上很简单也很快速，但要成功地进行凝胶迁移实验，需要优化一些参数，这 主要受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响。以下是需要优化的因素：抽提液的制备（核 酸酶和磷酸酶污染会使探针降解） ，结合蛋白的浓度，探针的浓度，非特异性探针的浓度，缓冲液的配

6、方和 pH,聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件，保温时间和温度，载体蛋白，是否有辅助因子（比如锌，或镉等金属离子，或激素）。总之，反应总体积应最小（ 20ul、。为满足一般要求，结合缓 冲液含 4%甘油，1mMMgCl2, 0.5mMEDTA, 0.5mMDTT, 50mMNaCl, 10mMTris-HCl（pH7.5）, 0.05mg/ml poly（dl:dC）?dl:dC, 或 10mMHEPES（pH7.9）, 50mMKCl, 1mMDTT, 1mMEDTA, 10% 甘油， 0.05mg/ml poly（dI:dC）?dI:dC可作为优化实验的起始。参考凝胶迁移实验技术手册TB110

7、 获取更多的资料。5）提供了哪些同源的多核苷酸引物，这些引物的序列来源是什么？有各类 dsDNA 探针，它们含各种转录调控因子的同源结合位点。下表列岀了所能提供的探针，和 这些引物序列的岀处。转录调控因子探针 探针名 目录号 序列（上链） 序列的出处Sp1 E3231,E3232 5-ATT CGA TC G GGG CGG （GC GCG-3 SV40 启动子（1）API E3201 E3202 5-CGC T TG ATG AGT CAG CCGGAA-3 胶原酶基因 TRE（ 2）AP2 E3211 E3212 5-GAT C GA ACT GAC CGC CCG CGG CCC Gh

8、人金属硫堇 Ila（3）基因 NF-kB E3291, E3292, 5-AGT T GA GGG GAC TTT CC AGG C-3 鼠 Igk 轻链基因（4）Octi E3241 E3242 5-TGT CG A ATG CAA ATC ACT AGA A-3 Ig 重链基因（5）CREB E3281 E3282 5-AGA GA T TGC CTG ACG TCA GAC AG） TAG-3 大鼠生长激素抑制基因（6）TFIID E3221 E3222 5- GCA GAG CAT ATA AGG TGA GGT AGG ABbelta-1 球蛋白启动子 只列出了上链的序列，探针是双链

9、，下链序列和上链序列配对。黑体字表明序列来源于指定的基 因序列，转录调控因子结合的序列用下线表明。一般而言，周围的核苷酸是任意。6）在 DNA 探针的选择上，要考虑哪些重要因素？目的 DNA 的长度应小于 300bp，以有利于非结合探针和蛋白DNA 复合物的电泳分离。双链的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作探针。如目的蛋白已被鉴定，则应用短的寡 核苷酸片段（约为 25bp） ,这样结合位点可和其他因子的结合位点区别开。 长的限制性酶切片段可 用于对推定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位。随后可用DNaseI 印迹对蛋白结合的特异区域在 DNA 序列水平上作岀分析。7）用

10、以下一些转录调节因子和 HeLa 细胞核抽提物可形成哪些复合物：API, AP2, CREB, NFkB,Octi, Sp1, TFIID, TFIIB 。当用 HeLa 细胞核抽提物作为结合蛋白的来源时，每1 个转录调节因子和它相关的DNA 同源序列结合形成特征型的结合形态。以下的文字描述了每一个单独的转录调节因子，包括识别的同源序列，因子的大小，特定的结合条件，以及和HeLa 细胞核抽提物可形成的复合物的数目。1.API: AP1 （激活蛋白 1）是一个转录调节因子，它结合的同源序列为5-TGAGTCA-3。当基因的启动子区域存在 AP1 的结合位点时，这些基因可以被诱导，比如用佛波酯可诱

11、导蛋白激酶（2,7）。在细胞中，AP1 形成 c-Jun 或 Jun 相关蛋白的同聚双体，或者形成c-Jun 或 Jun 相关蛋白和 c-Fos或 Fos 相关抗原（Fras ）的异源双体。Fos 蛋白自身不能形成同聚双体，并不能单独和AP1 结合位点结合。c-Jun 蛋白是一个 40kDa 的单体蛋白并通过亮氨酸拉链形成同聚双体。在HeLa 细胞中，AP1 的主要形式是 c-Jun 蛋白的同聚双体。在凝胶迁移实验中，形成一个特异的复合物。当作凝胶 迁移实验测定 AP1 的活力时，除了基本的溶液组分外，应将 0.01mg/ml poly（dl:dC）?dl:dC）,100ugBSA, 5mMD

12、T 功廿入到结合缓冲液中。如用纯化的蛋白，则用1-2ug 的蛋白来检测迁移复合物。2.AP2: AP2 是一个转录调节因子，可分别作为TPA-和cAMP诱导因子（10）。它是一个 52 kDa 的蛋白，识别的同源序列为5-CCCCAGGC-3 或 5-GCCNNGGC-3（ 3）。这个因子对视黄酸特别敏感，可能在形态发生中起着重要作用。HeLa 细胞核抽提物和 AP2 同源 DNA 探针形成一个特定的复合物。用纯化的蛋白作凝胶迁移实验时，应用20-50ng 的蛋白。3.CREB CREB 是个 37kDa 的转录调节因子，对 cAMP 应答，识别 5-T （ G/T） ACGTCA-3DNA

13、同 源序列（6 ,11）。它含亮氨酸拉链结构而形成同聚双体，相关的基本结构域和c-JunDNA 结合结构 域同源。当用 HeLa 细胞核抽提物时，能和 CREB 同源序列形成一个复合物。4.NF-kB: NF-kB 最初被鉴定为在 B 细胞中和免疫球蛋白 k 轻链的增强子结合。 但随后在非 B-细 胞的细胞质中被发现， 形成 NF-kB 和 I kB 的复合物。 最初在 DNA结合蛋白复合物中分离的 NF-kB 是由 p65（RelA）和 p50 构成的异源双聚体。其他分离的单体包括 p49 （也可称为p52 ），p75（c-Rel ） ,p68（RelB）。p65，p68，p75 单体起反式

14、激活作用。p50，p49 （ p52）单体具有 DNA 结合活力，但只具有微量的反式激活作用。据报道 p49 和 NF-kB 的单体 p65 形成具有转录活力的异源双体，类似于 p50/ p65 异源双体。p49/ p65 和 p50/ p65 异源双体在细胞质中受一种叫IkBa/MAD-3的抑制剂调节。IkB 和 p65 单体结合，阻制了细胞核中的定位和DNA 的结合。在体外高浓度的p65能形成同源双聚体，能和DNA 微弱地结合。Poly(dl:dC) 能抑制这一反应(14)。p49 和 p50 也能形成同源双聚体，但在细胞中的浓度很低。通常，在作NF-kB 的凝胶迁移实验时，在 20ul

15、的反应体积中，有溶于 10 mMHEPES 勺 0.28pmoles 的 NF-kB9 寡核苷酸(pH7.9), 50mMKCl, 0.2mMEDTA,2.5mM DTT, 10%甘油，0.05%NP-40。当用纯化的蛋白时，250-300ng 足以形成凝胶迁移复合物，而需用10ug 的 HeLa 细胞核抽提物。 凝胶迁移复合物在室温中保温30 分钟，在 50mMTris(pH8.3)和 38mM 甘氨酸的 7%聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离凝胶迁移复合物。含考马斯兰和二甲苯蓝色素的加样溶液只 能加入到阴性对照反应中，因这两种色素会加剧NF-kB 复合物的解离。当用 HeLa 细胞核抽提物作为结合蛋

16、白来源时，可形成两种序列特异的凝胶迁移复合物，即p50/p50 同源双聚体和 p50/ p65异源双聚体。在表达 p49，p50，p65 的细胞中，可检测到 4 个序列特异的凝胶迁移复合物(p49/ p49，p50/ p50 ，p50/ p65 ，p49/ p65 )，如果存在高浓度的p65，可检测到微量的p65/p65。下列试剂可加强 NF-kB 在体外的结合：mM 的 GTP ATP,精胺，亚精胺，钡或钙离子，ng 的 Co+3(NH3)6 (12)5. OCT1 OCT 是 OCT 转录调节因子家簇中的一员，显然在哺乳细胞中存在比较广泛(5)。POU 结构域包括 POU-box 和 Ho

17、meo 结构域。当用 HeLa 细胞核抽提物时，可检测到一个与OCT1 同源探针形成的序列同源凝胶迁移复合物。6.SP1:SP1 是一个 O-糖基化的转录调节因子，它识别 10 个核苷酸长度的同源序列5-GGGGCGGGGC-3(1)。核心识别序列是 5-GGGGCGGG-&同核心序列相似的序列常存在于启动子中。SV40 的早期启动子就是一个例子，它是第一个可以结合SP1 的启动子。根据糖基化的不同，它的分子量在95-105kDa，DNA 结合结构域中的三个锌指纹决定了序列的特异性。HeLa 细胞核抽提物与 SP 侗源探针形成特异的凝胶迁移复合物。7. TFIID/TFIIB : TF

18、IID 和 TFIIB 是基本的转录调节因子，参与RNA 聚合酶 II 启动子的基本的转录(16)。TFIID 与真核启动子的 TATA 区域形成特异的 DNA 结合。TFIID 由几个蛋白组成，而其中 的 TATA 区域结合蛋白(TBP)，参与 TATA 序列的结合。TFIID 的其他的蛋白组分被称为TBP-相关因子(TAFs)o用 TFIID 探针寡核苷酸和 HeLa 细胞核抽提物，可得到一个微弱的凝胶迁移带，但 很难确定为是 TFIID 序列特异凝胶迁移复合物。纯化的重组的TBP 很难作凝胶迁移实验，这部分是由于 TBP 存在很强的正电荷，导致TBP/DNA 复合物很难进入凝胶。纯化的T

19、BP 形成二聚体后不能结合 DNA( 17)o因此形成的二聚体可参与DNA 结合。TFIIB 不单独与 DNA 结合，但与 TFIID 结合后增强它与 DNA 的结合。TFIIB 与预启动复合物结合后，致使RNA 聚合酶 II 和 TFIIF 结合到转录启始区。故TFIIB 在预启动复合物的形成中有重要作用。当用纯化的 TFIID 作凝胶迁移实验时，poly(dI-dC)不用加入结合反应中。结合缓冲液含 10%甘油，20mMTris(pH8.0), 10mMMgCl2, 2mMDTT, 89mMKCl 。对 TFIID 的 凝胶结合实验中，可加入 poly (dG:dC) ?dG:dC。形成的

20、复合物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中 分离，凝胶组分是：0.5 TBE, 6%聚丙烯酰胺凝胶(19:1 丙烯酰胺：双叉),4mMMgCl2, 0.02%NP-40, 电泳缓冲液组分是：0.5 TBE 4mMMgCl2,0.02%NP-40。当研究含 TFIID 和 TFIIB 的复合物时，应从结合缓冲液，凝胶，和电泳缓冲液中去除MgCl2。这些是一般的要求，用不同的细胞抽提物和 TFIID、TFIIB 形成复合物作凝胶迁移实验时，应对多种因素进行优化以达到理想的条件。8) 在一次凝胶迁移实验中，用多少量的蛋白质或抽提物，和标记的DNA 探针？对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化

21、蛋白，粗制核抽提液需作优化，一般所用纯化蛋白的量在 20-2000ng 间，可将蛋白：DNA 的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA 的 5倍。用粗制核抽提液，需要 1-20ug 蛋白形成特异的复合物。所加入反应的探针的量是 50, 000-200，000cpm32P-标记的探针(高特异活性)，反应体积为 1-5ulo这相当于 10-50fmoles 的 DNA 探针。 探针应保存在-20oC以防止降解，在合成或标记后1-2 个星期内必需使用。无论探针或是结合蛋白应避免多次冻融。9) 能用体外翻译法制备目的蛋白质吗？Promega 没对所有的转录调节因子作这类测试。一般，用麦胚抽提物作哺乳细胞转

22、录因子或DNA结合蛋白的体外翻译，兔网织红细胞溶裂解液可能含有内源哺乳细胞转录因子或DNA 结合蛋白。但 TNT？ /sup兔网织细胞溶解液系统（a,b,c,d ）与 TranscendTM 生物素标记的 tRNA（目录号E3201） 同使用，翻译了转录调节因子AP1（ c-Jun），它使 AP1 同源寡核苷酸（目录号 E3201 ）产生的迁移效果和重组的AP1 相同（18）。TNT？ /supT7 偶联的麦胚抽提物（b,c,d,e ）在体外翻译了 c-Rel。这一蛋白特异地使免疫球蛋白k 轻链增强子探针产生迁移。在c-Rel 结合反应中加入体外翻译的 MAD-3（ IkB 家簇中一员）可干扰

23、其相互作用。10）poly（dl:dC）?dl:dC），非特异性竞争 DNA 特异性竞争 DNA 的功能是什么？它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。 在凝胶迁移反应中加入poly（dl:dC）?dl:dC），可抑制粗制核抽提液中其它DNA 结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly（dl:dC）?dl:dC） ，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每 2-3ug核抽提液用 1 ug poly（dI:dC）?dI:dC）。为确定所形成的复合物的特异性，在含或不含

24、增量的非放射性的特异竞争 DNA 或非特异的竞争 DNA 时，作结合反应的竞争实验。一般，非放射性的特异 DNA 是非标记的 DNA探针，非特异的竞争DNA，长度组成和 DNA 探针相同，序列不同。用非放射性的特异 DNA 能竞争掉，而用非特异的竞争DNA 不能竞争掉的复合物，表明目的蛋白和同位素标记探针的特异 结合。非 特异 结合 能用特异 DNA 和非 特异 的竞争 DNA 竞争掉。结 合溶 液中的 poly（dI:dC）?dI:dC） 的量需作优化，但一般用 0.05mg/ml。非放射性的（特异或非特异）的竞争 DNA 的用量也需优化或滴定，但竞争 DNA 通常是同位素标记的探针的10-

25、1000 倍（w/w）。其他类型的竞争 DNA 如小牛胸腺 DNA 不能用于凝胶迁移反应，它们会带有目的蛋白的结合位点。11）用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%（ 30： 1 丙烯酰胺：双叉），在特定条件下可用高或低的浓度。PH,聚丙烯酰胺的浓度，丙烯酰胺：双叉丙烯酰胺的比会影响复合物在凝胶中的迁 移。大多数蛋白用 10-15伏的电压，解离快的蛋白用短时间和高的电压（30-35 伏的电压），电泳时所用的 TBE 和 TAE 必需是新配制的，无沉淀

26、。低的离子强度和丙烯酰胺基质的 箱子效果 有助于复合物的稳定。也可将TGE 缓冲液（12.5mMTris,pH8.3, 95mM 甘氨酸，0.5mMEDTA 用于不稳定的蛋白/DNA 复合物。可在 4oC 进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。加样样品 液中的色素会导致不稳定复合物的解离，应用不含考马斯兰和二甲苯蓝的加样样品液。当带型不 紧密岀现拖尾时，表明复合物存在解离。凝胶必需完全聚合，以避免带型拖尾。如复合物不进入 凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含 游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽

27、提液中和 结合反应中加入相应的抑制剂。目前可用高强度琼脂糖凝胶分离蛋白/探针复合物（Metaphor?/sup/agarose ）。12） 如何在一个特定的复合物中确定一个蛋白质的存在？部分纯化的蛋白或粗制核抽提液和一个特定的探针可形成一个或几个特异的蛋白复合物。 多个复 合物的存在表明蛋白降解，应在制备抽提液的溶液中和结合反应中加入蛋白酶抑制剂。确定复合 物中蛋白的特征可能会困难，但有一些方法作这方面的研究。如有目的蛋白的抗体，可进行超迁 移实验，抗体和蛋白/探针复合物中的蛋白结合，使复合物的迁移延迟，形成超迁移。增量的抗体 加入到结合反应中。抗体可加入到蛋白和探针反应后，也可将抽提物与抗体

28、结合后，再加入探针。 取决于抗体的特定的抗原决定簇，前者有利于超迁移复合物地形成，后者阻止复合物的形成导致 原复合物的强度的减少。在大多数实验中，应对抗体作滴定，先使抗体：蛋白的摩尔比为1: 1，然后应需要增加抗体的量。当有纯化的蛋白时，可用它们和实验的带型迁移复合物比较。除超迁 移实验外，复合物中蛋白的特征也可用UV 交联和标记转移来分析。在均质标记的探针和细胞核抽提物保温后，用 UV 照射使复合物交联，随后用DNA 酶降解未保护的探针。需用均质标记的探针，因 DNA 酶会从末端标记的探针中除去标记。和保护的几个核苷酸交联的蛋白在变性聚丙烯酰胺凝 胶中经电泳分离，干燥，放射自显影。结合蛋白的

29、分子量可和标准分子参照物比较。也可用目的 蛋白的抗体对复合物作 Western 印迹分析(20)。 如一个蛋白和 DNA 探针的特定序列结合，可用含保守结合序列的竞争寡核苷酸，以及突变体来确定它的特征。也可用定点突变将保守序列结合位 点改变来研究复合物的形成。参考资料1. Briggs M R et al 1986 Scie nee 234, 472. Lee W et al 1986 Cell 49, 7413. Williams T et al 1989 Genes Dev 2, 15574. Sen R and Baltimore D 1986 Cell 46, 7055. Parlso

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34、P1 保守序列寡核苷酸）（AP1 保守序列寡核苷酸）（NFkB 保守序列寡核苷酸）（AP2 和 SP1 保守序列寡核苷酸和转录调节因子）（AP1 转录调节因子）植物基因工程表达载体的改进和优化策略植物基因工程表达载体的改进和优化策略将特定的外源基因构建在植物表达载体中并转入受体植物，并不是植物遗传转化的最终目的。理想的转基因植物往往需要外源基因在特定部位和特定时间内高水平表达， 产生人们期望的表型性状。然而，近二十年的发展历史却表明，外源基因在受体植物 内往往会出现表达效率低、表达产物不稳定甚至基因失活或沉默等不良现象，导致转 基因植物无法投入实际应用。另外，转基因植物的安全性问题已在许多国家

35、引起人们 的关注，例如，转基因有可能随花粉扩散，抗生素筛选标记基因有可能使临床上的某 些抗生素失去作用等等。以上问题的出现使得植物基因工程这一高新技术正处于一种前所未有的困扰时期。针对这些问题，近几年人们对植物转基因技术进行了多方面的 探索和改进，植物表达载体的改进和优化就是其中最重要的一项内容，本文就已经取 得的进展进行综述。1启动子的选用和改造外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外 源基因表达首先要考虑的问题。目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基

36、因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体 植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植 物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不 利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。已发现的特异性启动 子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子、果实 特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特

37、异性启动子、 化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。这些特异 性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于 该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫 基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。在植物转基因研究中， 使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果， 尤其是 在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。对现有启动子进行改造，构 建复合式启动子将是十分重要的途径。例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动

38、子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS 表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。在 植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。2增强翻译效率为了增强外源基因的翻译效率，构建载体时一般要对基因进行修饰，主要考虑三 方面内容：2.1添加5-3-非翻译序列许多实验已经发现，真核基因的5-3-非翻译序列（UTR）对基因的正常表达是非常必要的，该区段的缺失常会导致mRNA的稳定性和翻译水平显著下降。例如，在烟草花叶病毒（TMV

39、）的126kDa蛋白基因翻译起始位点上游，有一个由68bp核苷酸组成的Q元件，这一元件为核糖体提供了新的结合位点，能使Gus 基因的翻译活性提高数十倍。目前已有许多载体中外源基因的5-端添加了Q翻译增强序列。Ingelbrecht等曾对多种基因的3-端序列进行过研究，发现章鱼碱合成酶基因的3-端序列能使NPTII基因的瞬间表达提高20倍以上。另外，不同基因的3-端序列增进基因表达的效率有所不同，例如，rbcS3-端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的3-端序列高60倍。2.2优化起始密码周边序列虽然起始密码子在生物界是通用的，然而，从不同生物来源的基因各有其特殊的起始密码周边序列。例如，

40、植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUGC,动物起始密码子周边序列为CACCAUG，原核生物的则与二者差别较大。Kozak详细研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体的构建中。例如，有一个细菌的几丁质酶基因，原来的起始密码周边序列为UUUAUGG，当被修饰为ACCAUGG，其在烟草中的表达水平提高了8倍。因此，利用非植物来源的基因构建表达载体时，应根据植物起始密码子周边序列的特征加以修饰改造。2.3

41、对基因编码区加以改造如果外源基因是来自于原核生物，由于表达机制的差异，这些基因在植物体内往 往表达水平很低，例如，来自于苏云金芽孢杆菌的野生型杀虫蛋白基因在植物中的表 达量非常低，研究发现这是由于原核基因与植物基因的差异造成了mRNA稳定性下降。美国Monsanto公司Perlak等人在不改变毒蛋白氨基酸序列的前提下，对杀虫蛋 白基因进行了改造，选用植物偏爱的密码子，增加了GC含量，去除原序列下影响mRNA稳定的元件，结果在转基因植株中毒蛋白的表达量增加了30100倍，获得了明显的抗虫效果。3消除位置效应当外源基因被移人受体植物中之后，它在不同的转基因植株中的表达水平往往有 很大差异。这主要是

42、由于外源基因在受体植物的基因组内插入位点不同造成的。这就 是所谓的”位置效应”。为了消除位置效应，使外源基因都能够整合在植物基因组的转 录活跃区，在目前的表达载体构建策略中通常会考虑到核基质结合区以及定点整合技 术的应用。核基质结合区（matrix association regi on ,MAR）是存在于真核细胞染色质中的一段与核基质特异结合的DNA序列。一般认为，MAR序列位于转录活跃的DNA环状结构哉的边界，其功能是造成一种分割作用，使每个转录单元保持相对的独立性，免受周围染色质的影响。有关研究表明，将MAR置于目的基因的两侧，构建成包含MAR-ge ne-MAR结构的植物表达载体，用于

43、遗传转化，能明显提高目的基因的表达 水平，降低不同转基因植株之间目的基因表达水平的差异，减少位置效应。例如，Allen等人研究了异源MAR（来自酵母）和同源MAR（来自烟草）对 |Gus 基因在烟草中表达的影响，发现酵母的MAR能使转基因表达水平平均提高12倍，而烟草本身的MAR能使转基因的表达水平平均提高60倍。使用来源于鸡溶菌酶基因的MAR也可起到同样作用。另一可行的途径是采用定点整合技术，这一技术的主要原理是，当转化载体含有 与寄主染色体同源的DNA片段时，外源基因可以通过同源重组定点整合于染色体的 特定部位。实际操作时首先要分离染色体转录活性区域的DNA片段，然后构建植物表达载体。在微

44、生物的遗传操作中，同源重组定点整合已成为一项常规技术，在动物 中外源基因的定点整合已获得成功，而在植物中除了叶绿体表达载体可实现定点整合以外，细胞核转化中还很少有成功的报道。4构建叶绿体表达载体为了克服细胞核转化中经常出现的外源基因表达效率低，位置效应及由于核基因随花粉扩散而带来的不安全性等问题，近几年出现的一种新兴的遗传转化技术-叶绿体转化，正以它的优越性和发展前景日益为人们所认识并受到重视。到目前为止，已在烟草、水稻、拟南芥、马铃薯和油菜（侯丙凯等，等发表）5种植物中相继实现了叶绿体转化，使得这一转化技术开始成为植物基因工程中新的生长点。由于目前多种植物的叶绿体基因组全序列已被测定，这就为

45、外源基因通过同源重组机制定点整合进叶绿体基因组奠定了基础，目前构建的叶绿体表达载体基本上都属于定点整合载体。构建叶绿体表达载体基本上都属于定点事例载体。构建叶绿体表达 载体时，一般都在外源基因表达盒的两侧各连接一段叶绿体的DNA序列，称为同源重组片段或定位片段（Targeting fragment）。当载体被导入叶绿体后，通过这两个片段与叶绿体基因组上的相同片段发生同源重组，就可能将外源基因整合到叶绿体基因组的特定位点。在以作物改良为目的的叶绿体转化中，要求同源重组发生以后，外源 基因的插入既不引起叶绿体基因原有序列丢失，又不致于破坏插入点处原有基因的功能。为满足这一要求，已有的工作都选用了相

46、邻的两个基因作为同源重组片段，例如rbcL/accD，16StrnV/rpsl2rps7,psbA/trnK,rps7/ndhB。当同源重组发生以后，外源基因定点插入在两个相邻基因的间隔区，保证了原有基因的功能不受影响。最近，Dan iel等利用烟草叶绿体基因trnA和trnI作为同源重组片段，构建了一种通用载体(universalvector)。由于trnA和trnI的DNA序列在高等植物中是高度保守的，作者认为这种载 体可用于多种不同植物的叶绿体转化。如果这种载体的通用性得到证实，那么这项工 作无疑为构建方便而实用的新型叶绿体表达载体提供了一个好的思路。由于叶绿体基因组的高拷贝性，定点整合

47、进叶绿体基因组的外源基因往往会得到高效率表达，例如McBride等人首次将Bt CrylA(c)毒素基因转入烟草叶绿体，Bt毒素蛋白的表达量高达叶子总蛋白的3%5%，而通常的核转化技术只能达到0.001%0.6%。最近，Kota等将Bt Cry2Aa2蛋白基因转入烟草转入烟草叶绿体，也发现毒蛋 白在烟草叶子中的表达量很高，占可溶性蛋白的2%3%，比细胞核转化高出2030倍，转基因烟草 不仅能抗敏感昆虫，而且能够百分之百地杀死那些产生了高抗性的昆 虫。Staub等最近报道，将人的生长激素基因转入烟草叶绿体，其表达量竟高达叶片 总蛋白的7%，比细胞核转化高出300倍。 这些实验充分说明，叶绿体表达

48、载体的构建和转化，是实现外源基因高效表达的重要途径之一。5定位信号的应用上述几种载体优化策略主要目的是提高外源基因的转录和翻译效率， 然而， 高水 平表达的外源蛋白能否在植物细胞内稳定存在以及积累量的多少是植物遗传转化中 需要考虑的另一重要问题。近几年的研究发现，如果某些外源基因连接上适当的定位信号序列，使外源蛋白产生后定向运输到细胞内的特定部位，例如：叶绿体、内质网、液泡等，则可明显提 高外源蛋白的稳定性和累积量。这是因为内质网等特定区域为某些外源蛋白提供了一个相对稳定的内环境，有效防止了外源蛋白的降解。例如，Wong等将拟南芥rbcS亚基的转运肽序列连接于杀虫蛋白基因之前，发现杀虫蛋白能够

49、特异性地积累在转基因烟草的叶绿体内，外源蛋白总的积累量比对照提高了1020倍。最近，叶梁、宋艳茹等也将rbcS亚基的转运肽序列连接于PHB合成相关基因之前，试图使基因表达产物在转基因油菜种子的质体中积累， 从而提高外源蛋白含量。 另外，Wan delt等和Schouten等将内质网定位序列(四肽KDEL的编码序列)与外源蛋白基因相连接，发 现外源蛋白在转基因植物中的含量有了显著提高。显然，定位信号对于促进蛋白质积 累有积极作用，但同一种定位信号是否适用于所有的蛋白还有待于进一步确定。6内含子在增强基因表达方面的应用内含子增强基因表达的作用最初是由Callis等在转基因玉米中发现的，玉米乙醇脱氢

50、酶基因(Adhl)的第一个内含子(intron 1)对外源基因表达有明显增强作用，该 基因的其他内含子(例如intron8,intron9)也有一定的增强作用。后来，Vasil等也发现玉米的果糖合成酶基因的第一个内含子能使CAT表达水平提高10倍。水稻肌动蛋白基因的第三个内含子也能使报道基因的表达水平提高26倍。至今对内含子增强基因表达的机制不不清楚，但一般认为可能是内含子的存在增强了mRNA的加工效率和mRNA稳定性。Tan aka等人的多项研究表明，内含子对基因表达的增强作用主要发生在单子叶植物，在双子叶植物中不明显。由于内含子对基因表达有增强作用，Mcelroy等在构建单子叶植物表达载体

51、时，特意将水稻的肌动蛋白基因的第一个内含子保留在该基因启动子的下游。同样,Christensen等在构建载体时将玉米Ubiquitin基因的第一个内含子置于启动子下游,以增强外源基因在单子叶植物中的表达。然而，有研究指出，特定内含子对基因表达 的促进作用取决于启动子强度、细胞类型、目的基因序列等多种因素，甚至有时会取例如，玉米Adhl基因的内含子9置于|Gus 基因的5端， Gus 基因的表达未见增强；当把内含子置于|Gus 基因3Gus 基因的表达水平却增加了大约3倍。由此可见，内含子对基因表达的作用机制可能是很复杂的，如何利用内含子构建高效植物表达载 体，目前还缺乏一个固定的模式，值得进一

52、步探讨。7多基因策略迄今为止，多数的遗传转化研究都是将单一的外源基因转入受体植物。但有时由 于单基因表达强度不够或作用机制单一，尚不能获得理想的转基因植物。如果把两个或两个以上的能起协同作用的基因同时转入植物，将会获得比单基因转化更为理想的结果。这一策略在培育抗病、抗虫等抗逆性转基因植物方面已得到应用。例如，根据 抗虫基因的抗虫谱及作用机制的不同，可选择两个功能互补的基因进行载体构建，并 通过一定方式将两个抗虫基因同时转入一个植物中去。王伟等将外源凝集素基因和蛋白酶抑制剂基因同时转入棉花，得到了含双价抗虫基因的转化植株。Barton等将Bt杀虫蛋白基因和蝎毒素基因同时转入烟草，其抗虫性和防止害

53、虫产生抗性的能力大为提咼（专利）。在抗病方面，本实验室蓝海燕等构建了包含3-1,3-葡聚糖酶基因及几丁质酶基因的双价植物表达载体，并将其导入油菜和棉花，结果表明，转基因植株均产生了明显的抗病性。最近，冯道荣、李宝健等将23个抗真菌病基因和hpt基因连在一个载体上，两个抗虫基因与bar基因连在另一个载体上，用基因枪将它们共同导入水稻植株中，结果表明，70%的R。代植株含有导入的全部外源基因（67个），且导入的多个外源基因趋向于整合在基因组的一个或两个位点。一般常规的转化，尚不能将大于25kb的外源DNA片段导入植物细胞。而一些功能相关的基因，比如植物中的数量性状基因、抗病基因等，大多成”基因簇”的形式存在。如果将某些大于100kb的大片段DNA,如植物染色体中自然存在的基因簇或并不 相连锁的一系列外源基因导入植物基因组的同一位点，那么将有可能出现由多基因控制的优良性状或产生广谱的抗虫性、抗病性等，还可以赋予受体细胞一种全新的代谢 途径，产生新的生物分子。决于内含子在载体上的位置。在CaMV35S启动子调控下,端，在同样的启动子控制下，不仅如此，大片段基因群或基因簇的同步插入还可以在一 定程度上克服转基因带来