鼻息肉患者嗜酸性粒细胞及肥大细胞脱颗粒电镜观察

1、    鼻息肉患者嗜酸性粒细胞及肥大细胞脱颗粒电镜观察作者：武宇宏    作者单位：河北北方学院附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科 075000【摘要】  目的：为了解活化的嗜酸性粒细胞及肥大细胞的脱颗粒情况，应用透射电镜观察嗜酸性粒细胞及肥大细胞的形态变化、颗粒情况及脱颗粒类型，借此探讨嗜酸性粒细胞及肥大细胞在鼻息肉发病机制中的作用，找到一种预防鼻息肉的好方法。方法：鼻息肉组10例，鼻息肉组织来自2001年我科住院做鼻内窥镜手术的多发性鼻息肉病人，男6例，女4例。正常对照组5例，选取同期因鼻外伤住院病人，男4例，女1

2、例。所有组织均在鼻内窥镜下采取，病变组取息肉组织，对照组取下鼻甲组织，标本迅速放入10%甲醛液及4%戊二醛液固定，分别供光镜及电镜检查备检，HE染色及常规电镜制片。结果：光镜下可见大量炎性细胞浸润，以嗜酸性粒细胞为主，主要位于黏膜下，小血管周围；正常对照组炎细胞较少，统计学分析鼻息肉组嗜酸性粒细胞数目明显高于正常对照组，且有显著性差异(P<0.05)。肥大细胞的超微结构特点：正常对照组多为正常肥大细胞，大小基本一致，胞浆内多为高电子密度颗粒，表面可见微绒毛，无空泡形成；鼻息肉组：绝大多数为脱颗粒肥大细胞，表现为颗粒变大、电子密度减低、颗粒间相互融合、颗粒与胞膜融合、空泡形成。另外在息肉组

3、织内可见浆细胞存在，有一较大的核，核内异染色质呈斑块状，分布在核周围，胞浆内充满膨大的粗面内质网，说明蛋白合成旺盛。结论：经研究我们发现鼻息肉组织中有大量的炎性细胞浸润，其中以嗜酸性粒细胞最多，而且大部分是活化状态，嗜酸性粒细胞及肥大细胞脱颗粒后释放炎性介质、细胞毒性蛋白及细胞因子等生物活性物质，引起上皮脱落、组织水肿、血管增生，最终导致鼻息肉的发生和发展，鼻腔局部应用皮质类固醇激素可以抑制炎性细胞的聚集和活化，减轻组织中的炎性反应，从而达到控制鼻息肉的目的。【关键词】  鼻息肉；嗜酸性粒细胞；肥大细胞；脱颗粒；超微结构    Degranulation

4、 Patterns of Eosinophils and Mast Cells in the Nasal Polyps    WU Yu-hong    The First Affiliated Hospital， Hebei North University ,Zhangjiakou,075000,China    【ABSTRACT】  Objective: Nasal polyps usually contained many  inflammatory cells such a

5、s, eosinophils, plasma cells, mast cells, neutrophils and  lymphocytes. The eosinophils and mast cells were most common. Degranulation of eosinophils in target tissues is considered a key pathogenic event in major chroniceosinophilic diseases. However, because of a lack of appropriate methods,

6、littleis known about degranulation of eosinophils in nasal polyps. With the application of transmission electron microscopic analysis, a novel approach was devised and validated to quantify eosinophil and mast cell degranulation in human tissues, by observing degranulation of eosinophils and eosinop

7、hils and mast cell.Methods:  Biopsy specimens from cases with nasal polyposis (6 male and 4 female) and normal nasal mucosa (4 male and 1 female) from cases with nasal injury were evaluated. Biopsies taken from the nasal polyps of the cases and the inferiorturbinate of cases of nasal injury wer

8、e studied with the light and transmission electron microscope.Results: The most conspicuous feature ofeosinopils is the presence of a large number of eosinophilic granules havingcrystalloid material in an equatorial position. Two conditions display a varyingdegree of local tissue eosinophilias and m

9、ast cells, with great differencebeing observed in eosinophil numbers in the nasal polyps cases turbinate. The degranulation of the eosinophils and mast cells were observed only in the eosinophils and mast celles were observed only in the nasal polyps. The eosinophil subtypes were intact and resting

10、in the normal nasal mucosa, however in the nasalpolyps, the eosinophils were intact but degranulating (piecemeal deguanulation).Eosinophils cytolytic or fegs were not observed in the patient groups. Thecontent of the crystalloid core disappeared in many granules of the eosinophilswere also observed.

11、 More mast cells were found in the base of nasal polyps andand most of them showed varying degrees of degranulation. Conclusion: Polyps contained significantly more eosinophils than nasal mucosa. When eosinophils and mast cells degranulated, their cytoxic granule proteins would release. This conditi

12、on resulted in cell injury, tissues edema and progressive eosinophils infiltration. This findings suggested that active inflammation was associated with eosinophils and mast infiltration had a close relation with edema formation, which resulted in the growth of nasal polyps. The study revealed that

13、degranulation eosinophils and mast cells in nasal polyps played an important role in the formationand growth of nasal polyps.    【KEY  WORDS】  nasal polyps; eosinophils; mast cell; degranulation; ultrastructure    鼻息肉是耳鼻喉科常见的鼻部疾病，且有逐年增多的趋势。鼻息肉多来自筛窦、中鼻道及中鼻甲，发病率

14、高，且容易复发，组织病理学上为呼吸上皮遮盖着极度水肿的间质，间质中有大量炎性细胞浸润，以嗜酸性粒细胞为主13，伴有少数失神经支配的血管，缺乏真正的浆黏液腺和前浆液腺，可见不规则的囊性扩张的腺体，黏膜下明显水肿，间质中可见大量成纤维细胞。鼻息肉的发病机制相当复杂，且不甚明了，长期以来变态反应是鼻息肉的重要病因之一，认为鼻息肉是IgE介导的型变态反应4，5，导致肥大细胞脱颗粒和组胺等介质的释放，引起血管通透性增加、组织水肿和鼻息肉形成。    本研究通过光镜及电镜观察鼻息肉患者鼻息肉组织及正常对照组下鼻甲组织中嗜酸性粒细胞及肥大细胞的数量及细胞的形态，细胞质颗粒的形态

15、和脱颗粒情况，借此探讨鼻息肉的发病机制，阐述活化的嗜酸性粒细胞及肥大细胞在鼻息肉发生发展中的作用，并探讨鼻息肉的治疗方法。    1  材料和方法    1.1  标本来源和制备  鼻息肉组10例，鼻息肉组织来自2001年我科住院做鼻内窥镜手术的多发性鼻息肉病人，男6例，女4例；年龄2258岁，平均年龄40岁。根据1997年海口会议制定的慢性鼻窦炎、鼻息肉临床分型、分期标准，经鼻内窥镜检查及CT检查，型2期2例，3期3例，型5例，无变应性鼻炎史及急性感染病史，近期均无应用类固醇药物、抗组胺及抗生素药物史,

16、且术后均经病理证实。正常对照组5例，选取同期住院的鼻外伤病人，男4例，女1例。所有组织均在鼻内窥镜下采取，病变组取息肉组织，对照组取下鼻甲组织，取出标本后，光镜标本迅速放入10%甲醛中充分固定，石蜡包埋后备检，透射电镜标本用生理盐水冲洗后迅速置入4%戊二醛液中放冰箱冷藏固定备检。    1.2  组织病理学染色（HE染色）  鼻息肉及下鼻甲粘膜标本经常规石蜡包埋后连续切片，层厚5m，同时制片行HE染色检查嗜酸性粒细胞数量。    1.3  透射电镜标本处理  4%戊二醛固定，磷酸缓冲液清洗，1%

17、锇酸固定，磷酸缓冲液清洗，丙酮脱水，浸透包埋，超薄切片日立H7500透射电镜观察。    1.4  结果分析方法  HE染色标本上嗜酸性粒细胞以双核、胞浆中含有大量桔黄色小颗粒为特征，在多倍显微镜（10×40）下对每一个标本随机取10个不同视野，在装有100倍网格目镜测微器下，计数网格中嗜酸性粒细胞数量，取平均值代表嗜酸性粒细胞的个数，采用SPSS统计软件对实验组和对照组各数据进行分析，用T检验，计算出P值，P<0.05为差异有显著性。透射电镜标本：透射电镜下观察鼻息肉组织特点，炎性细胞及特征，尤其是嗜酸性粒细胞和肥大细胞的形态

18、和脱颗粒情况。   2  结果    2.1  HE染色光镜检查  鼻息肉组织中上皮增生变厚，上皮性质不一，多为呼吸上皮，部分有单层柱状上皮、鳞状上皮、间质水肿，可见长管状腺，大量炎性细胞浸润，以嗜酸性粒细胞为主，主要位于黏膜下，小血管周围；正常对照组为假复层纤毛柱状上皮，固有层有浆液性腺体及黏液性腺体，炎细胞较少，统计学分析鼻息肉组嗜酸性粒细胞数目明显高于正常对照组，且有显著性差异(P<0.05)。    2.2  透射电镜检查  嗜酸性粒细胞的超微结构特点

19、：正常对照组嗜酸性粒细胞数量较少，均为静息态嗜酸性粒细胞，胞膜完整无突起，胞浆颗粒密度一致，中心键位于中央与颗粒长轴平行，胞浆内无空泡；活化期嗜酸性粒细胞在鼻息肉组织中非常多见，可见胞膜不完整且胞浆皱折增多，伸出伪足，伪足内可见颗粒或空泡，并观察到如下几种脱颗粒类型：（1）颗粒中心键消失，而颗粒样物存在；（2）中心键存在但颗粒丢失；（3）二者全丢失，留有空泡，此外可见空泡多位于胞浆周边并可见与膜融合的空泡，本研究未发现细胞溶解及胞外颗粒的情况。肥大细胞的超微结构特点：正常对照组多为正常肥大细胞，大小基本一致，胞浆内多为高电子密度颗粒，表面可见微绒毛，无空泡形成，未见到指纹样结构的颗粒；鼻息肉组

20、：绝大多数为脱颗粒肥大细胞，表现为颗粒变大，电子密度减低，颗粒间相互融合，颗粒与胞膜融合，空泡形成。有些空泡内可见不同电子密度的残余物质。另外在鼻息肉组织内可见浆细胞存在，有一较大的核，核内异染色质呈斑块状，分布在核周围，胞浆内充满膨大的粗面内质网，说明蛋白质合成旺盛。    3  讨论    鼻息肉是耳鼻喉科中一种难治疾病，多发性且很易复发，组织学上为呼吸上皮覆盖着极度水肿的间质，鼻息肉的上皮可有多种类型，如假复层纤毛柱状上皮、复层纤毛柱状上皮、单层柱状上皮、鳞状上皮等，可能是粘膜不断损伤、修复、化生的结果6。鼻息肉的病理

21、学特征：(1)上皮细胞增殖增强。上皮细胞增殖的意义不只是在于修复，更重要的是在于通过主动合成和分泌多种细胞因子，参与对黏膜炎症反应的调节；(2)炎性细胞大量浸润，尤其是嗜酸性粒细胞浸润。炎性细胞能合成和释放多种毒性蛋白和细胞因子，具有介质细胞、免疫调节细胞和抗原递呈细胞功能，与鼻息肉的形成有密切关系。传统观点认为嗜酸性粒细胞在局部的浸润是IgE介导的型变态反应致肥大细胞脱颗粒的结果，释放某些炎性介质，趋化嗜酸性粒细胞等至局部组织，发挥致炎作用，证据是在鼻息肉组织液中可测到组织胺和IgE且伴产生IgE的细胞数量增加，但I型变态反应为速发型，无法解释鼻息肉尤其是鼻息肉病的长期慢性过程7，Tonon

22、ori经过临床观察发现鼻息肉很少见于过敏性鼻炎患者，变态反应阳性的病人及依赖性过敏性疾病的病人鼻息肉发病率也不高。有些学者研究发现，淋巴细胞亚群特异性IgE抗体水平及肥大细胞数目在变态反应与非变态反应鼻息肉中无明显差异8，且非变态反应性鼻息肉中也有嗜酸性粒细胞的堆积，说明鼻息肉中嗜酸性粒细胞浸润并不意味着发生了变态反应9。    目前认为鼻息肉的发病是多因素、多步骤的过程，涉及到感染、变态反应、创伤、解剖异常、内环境和代谢紊乱、植物神经失调、离子通道改变、鼻腔气流动力学改变及遗传因素等参与整个炎症过程，而其中主要的组织病理变化是嗜酸性粒细胞的浸润，由于嗜酸性粒细胞

23、自身的生物学特征，人们发现该细胞的浸润对鼻息肉的发生发展起重要的作用，嗜酸性粒细胞趋化移行以及抑制其凋亡的微环境是鼻息肉形成的重要机理，涉及到多种细胞因子参与的复杂的过程，鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞增多是嗜酸性粒细胞选择性聚集的结果，可能机制：嗜酸性粒细胞趋化因子的作用以及细胞因子活化的内皮细胞对嗜酸性粒细胞的选择性粘附作用导致嗜酸性粒细胞从血管向组织中移行的数量增多，或组织中嗜酸性粒细胞的凋亡受到抑制，使存活时间延长10，11，参与此过程的细胞因子有IL-1、3、4、5、8，GM-CSF，TNF-等，共同作用使鼻息肉组织嗜酸性粒细胞浸润增多，进入组织中的嗜酸性粒细胞又在细胞因子的作用下被激活，

24、并延长存活时间，其中最重要的是IL-3、IL-5和GM-CSF。近年来研究证实，鼻息肉组织中的嗜酸性粒细胞可以合成和分泌一些重要的炎性和调节细胞因子，特别是IL-3、IL-5和GM-CSF，它们反过来可以促进嗜酸性粒细胞移行，刺激活化，抑制其凋亡，还可以增强代谢，促进炎症发展，所以鼻息肉可以被认为是鼻粘膜的一种自我延续的慢性嗜酸性炎症。    嗜酸性粒细胞在一些细胞因子的作用下，胞浆颗粒中所含的碱性蛋白由于自身体积空间构象及抗原性的改变，使其可溶性发生改变而脱颗粒，嗜酸性粒细胞被激活后，形态学发生改变，胞膜皱褶增多，可伸出伪足，伪足内含有大量密度不一的颗粒，胞膜常

25、呈崩解状态，胞浆空泡化明显或颗粒中心键脱失而颗粒存在等。嗜酸性粒细胞脱颗粒有两种方式：颗粒逐步移向胞膜排到胞外及细胞溶解，且不同情况下脱颗粒方式不同。嗜酸性粒细胞活化有两种类型：（1）胞内颗粒移向胞膜排到胞外基质中，遗留或多或少的空泡在完整的细胞内12，此种情况可导致长期和有选择的释放；（2）细胞溶解串珠样颗粒排出，导致快速而广泛的释放，认为嗜酸性粒细胞细胞溶解是嗜酸性粒细胞脱颗粒后释放毒性蛋白的结果13，虽然前一种形式被认为是最常见的脱颗粒形式，但有些学者则认为细胞溶解是潜在重要的活化机制，它的发生也可能是受胞内机制和生理学及药理学控制14。    本研究显示鼻

26、息肉标本中有大量嗜酸性粒细胞浸润，计数后和对照组相比，有显著差异，说明鼻息肉中存在着炎性反应。电镜观察鼻息肉组织内均为活化的嗜酸性粒细胞，出现上述脱颗粒的形态表现，而对照组中的嗜酸性粒细胞很少，且为静息状态，Stoop发现正常下鼻甲粘膜中虽有轻度或中度嗜酸性粒细胞浸润，但未见到活化的嗜酸性粒细胞，这一点与我们的研究结果一致，这说明鼻息肉组织中存在着活跃的炎症反应，炎症反应的程度与嗜酸性粒细胞的活化状态有关，而与嗜酸性粒细胞的总数无关。鼻息肉组织中的嗜酸性粒细胞被激活后，脱颗粒释放出多种介质和细胞因子，嗜酸性粒细胞颗粒中含有四种主要细胞毒碱性蛋白：嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白（MBP）、嗜酸性粒细胞

27、神经毒素（EDN）、嗜酸性粒细胞蛋白X（EPX）、嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）等，具有细胞毒性作用，可引起细胞及组织损伤，促进肥大细胞脱颗粒释放炎性介质，上皮细胞脱落，组织水肿，促使息肉形成。近来在变应性疾病的发病机制上，随着学者们提出Hygiene假说(即感染和变态反应之间处于拮抗的平衡状态），从而使感染和变态反应在鼻息肉发病过程中的作用受到广泛的质疑。    关于鼻息肉的形成多数学者认同的是鼻息肉形成的“上皮破裂理论”，Tos等研究认为息肉形成最初是水肿的粘膜固有层突出上皮破裂处，黏膜上皮通过破损边缘向中心生长趋于覆盖破损处，如再生的上皮生长速度无法覆盖疝

28、出的部位，或疝出部位生长较快，鼻息肉就此形成。由于重力的作用，鼻息肉将会不断增大。将鼻息肉的形成过程分为如下几期：（1）鼻黏膜细胞浸润或炎性水肿导致组织压力增高，进而上皮损伤，坏死，破裂，黏膜固有层疝出；（2）疝出部位上皮化；（3）腺体形成；（4）因重力作用息肉增大，腺体拉长；（5）已发育成熟的鼻息肉上皮及基质发生改变，如假复层上皮转化为复层上皮，杯状细胞的变化、浸润细胞类型的变化及基质水肿等。Bernstein提出鼻息肉的多因素发病学说，鼻腔外侧壁空气动力学变化，细菌病毒感染，以及变应性疾病等多因素均可作用于鼻腔外侧壁黏膜，引起炎症反应，继之按Tos等上皮破裂理论，开始上皮破裂，黏膜疝出，再

29、上皮化，新腺体形成，鼻息肉增长。此外，结合上皮破裂理论所反映的鼻息肉多因素、多步骤的发病过程，认为在鼻息肉发生初始时，在多种细胞因子的刺激下，上皮细胞释放多种生物活性物质，改变细胞内电解质的正常含量，导致鼻黏膜上皮的破损，息肉开始发生，之后，在其他理化因素如：窦口鼻道复合体阻塞，多种化学介质的共同作用下，形成恶性循环，息肉不断长大。加之这些被释放的具有损伤上皮细胞作用的化学介质如缓激肽、白三烯等可引起鼻黏膜下水钠潴留，促使水肿形成和加重，导致组织间压力增加，上皮破裂，息肉发生。    肥大细胞脱颗粒：组织水肿是鼻息肉内最明显的病理学变化，Bumsted14发现鼻息

30、肉组织中组胺水平明显高于正常鼻黏膜，Drske-Lee等研究证实鼻息肉组织中有IgE介导的免疫反应。认为肥大细胞脱颗粒是I型变态反应的结果，但鼻息肉患者大多数无变态反应病史，且变应原皮试皆为阴性，鼻息肉中含有浆细胞，胞质内含有大量的粗面内质网，说明鼻息肉局部可以产生抗体，因此认为鼻息肉肥大细胞脱颗粒是非典型IgE反应，肥大细胞脱颗粒免疫反应非唯一因素，很多其它因素也可导致颗粒的释放。肥大细胞有三种颗粒：（1）高电子密度颗粒，有些颗粒中可有结晶状结构；（2）低电子密度颗粒呈网状结晶结构；（3）有些颗粒内同时含有不同电子密度的内容物，胞浆内有数量不等的空泡，空泡被膜完整或一些细胞膜消失，细胞周围可

31、见许多颗粒，形态结构与胞浆内颗粒无明显区别。Kawabor等认为肥大细胞脱颗粒时的形态变化有三个特征：（1）胞浆内颗粒肿胀；（2）伴有电子密度减低的纤维素样和网状改变颗粒；（3）颗粒物质消失，胞浆内遗有空泡。经观察我们发现正常肥大细胞多含高电子密度颗粒，活化的肥大细胞可见颗粒变大，密度减低及空泡形成。细胞形态可出现变化，符合上述特征。同时也发现了颗粒中有不同电子密度的物质，可能正处于脱颗粒过程中，表明肥大细胞脱颗粒需较长时间，而不能用传统的IgE介导理论来解释。李源等依胞浆内所含颗粒的不同，肥大细胞主要表现为三种形态：（1）脱颗粒前状态，胞浆内绝大多数为高电子密度颗粒，其余颗粒甚少或无，此形态

32、肥大细胞极少；（2）脱颗粒状态，胞浆内含有不同数量高、中和低电子密度颗粒，并有许多空泡，此形态肥大细胞较多；（3）空泡状态胞浆内仅有空泡，此形态也少见。颗粒释放的形态学变化规律是：高电子密度（尚未脱颗粒）中等电子密度（释放颗粒物质准备状态）低电子密度（颗粒物质释放，真正脱颗粒状态）空泡（颗粒物质释放殆尽，是颗粒物质释放完成状态）。脱颗粒前状态和空泡状态数量极少，提高肥大细胞脱颗粒后迅速解体。目前认为鼻息肉组织局部存在着IgE介导的变态及应导致肥大细胞浸润脱颗粒，释放炎性介质，招致包括嗜酸性粒细胞趋化因子(ECF-A)、血小板活化因子（PAF）和其他细胞因子IL-5、8、9等，导致嗜酸性粒细胞的

33、局部聚集，细胞损伤，组织水肿，同时也激活鼻息肉组织中的一些细胞，导致细胞因子的释放，进一步趋化嗜酸性粒细胞等炎症细胞，促进嗜酸性粒细胞增殖，活化脱颗粒释放强碱性蛋白，如MBP等，再次引起肥大细胞脱颗粒和介质释放，并可以促进B细胞转化为浆细胞合成IgE，形成恶性循环，使息肉组织内炎性反应长期持续发展，导致鼻息肉的生长和复发，是鼻息肉尤其是鼻息肉病长期迁延不愈的根本原因。   鼻息肉是一种以嗜酸性粒细胞选择性浸润为主要特征的鼻黏膜慢性炎症，近年来受到国内外学者的广泛重视，再组织学、发病原因和机制等方面目前已有较深入的认识15，16，一般认为，鼻息肉的发生是一个涉及多因素（感染、

34、变态反应、解剖异常等）、多步骤的过程，多种炎症因子的表达和嗜酸性粒细胞的作用是鼻息肉发生的重要环节，但在其发病和治疗方面，仍有很多问题需要进一步研究和解答17。【参考文献】1 Nakagawa T， Yamana H， Shigeta T，et al.Interaction between fibronectin and eosinophils in the growth of nasal polypsJ. Laryngoscope. 1999，109(4):557-612 Morinaka S， Nakamura H，Morinaka S，et al. Inflammatory cells

35、in nasal mucosa nasal polysJ. Auris-Nasus-Larynx, 2000, 27(1):59-643 Caversaccio M， Hartnell A， Calnan D，et al. The role of chemokines in nasal polypsJ, Schweiz-Med-Wochenschr. 2000，125：928-9584 Pawliczak R, Kowalski ML, Danilewicz M, et al. Distribution of mast cells and eosinophils in nasal polyps from atopic and nonatopic subjects: a morphometric studyJ. Am-J-Rhinol,1997,11(4):257-625 Stierna PL .Nasal polys; relationship to infection and in flammationJ. Allergy Asthma Proc,1996,17;251-2576 Settipane GA. Nasa