喉鳞状细胞癌DNA含量的FCM定量分析

1、    喉鳞状细胞癌DNA含量的FCM定量分析        内容提要选择24例未经治疗的喉鳞状细胞癌患者术后新鲜肿瘤标本,通过流式细胞仪(FCM)测定DNA含量的3个主要参数,异倍体(aneuploid)、DNA指数(DNA Index,DI)和S期细胞比例(S-phase fraction,SPF),探索3个参数与肿瘤组织学分级、临床分期以及淋巴结转移之间的关系。结果表明,24例喉鳞状细胞癌中,异倍体检出率为83.3%(2024)。DI与肿瘤组织学分级和淋巴结转移无关,与

2、肿瘤临床分期有关(P0.05)。SPF与肿瘤组织学分级无关,与临床分期及淋巴结转移有关(P0.01,P0.05)。提示:(1)DNA异倍体是喉鳞状细胞癌的重要特征之一;(2)DI和SPF可作为预测喉鳞状细胞癌生物学特性的重要指标。关键词喉肿瘤;流式细胞术;DNA倍体;DNA指数;S期细胞比例中国分类号R 739.65 THE QUANTITATIVE ANALYSIS OF DNA CONTENTSIN SQUAMOUS CARCINOMA OF LARYNX USING FCMYang QiuanZhao WeipingThe Affiliated Hospital of Shandong

3、Medical University,250012Qian ShaoJinan Women and Children Health HospitalAbstractFresh specimens from 24 previously untreated patients with squamous carcinomas of larynx(LSCC)were selected.Aneuploid,DNA index(DI)and S-phase fraction(SPF)were measured using flow cytometry(FCM).The association betwee

4、n these parameters with histologic grades,clinical stage and lymph node metastasis were studied.The results showed that the ratio of aneuploid was 83.3%(20/24).DI was not correlated with histologic grades and lymph node metastases,but correlated with clinical stages (P0.05).SPF was correlated both w

5、ith clinical stages(P0.01)and lymph node metastasis(P0.05).SPF had no relation with histologic grades.It is concluded that DNA aneuploid is one of the most important specialities in LSCC,meanwhile DI SPF can be regarded as significant predictors of biologic characteristics in LSCC.Key wordsLarynx ne

6、oplasms;Flow cytometry;DNA ploid;DNA index;S-phase fraction目前,临床肿瘤学上预测恶性肿瘤的生物学行为和预后仍主要根据其病理分级和临床分期等指标,以肿瘤的形态学表现特点为依据,它在一定程度上反映了肿瘤的生物学特性。随着对肿瘤认识的不断深入,学者们发现单从形态学上反映肿瘤特性有局限性,并受主观因素的影响,例如对良性肿瘤形态、恶性行为的肿瘤,对良、恶交界性肿瘤的诊断,会出现难以确定的情况;此外,肿瘤细胞复发、转移的生物学行为仅能部分从形态学上表现出来。临床上需要寻求能更准确反映肿瘤生物学特性的指标。对多数人类肿瘤进行DNA含量测定的结果表明

7、,DNA含量与恶性肿瘤的生物学特性、病理特征、预后等密切相关1。DNA含量高的肿瘤在分化、浸润、转移、复发及预后等方面常表现出较明显的恶性生物学行为。我们使用流式细胞仪测定了喉鳞状细胞癌DNA含量的3个主要参数:异倍体,DNA指数(DI)和DNA增殖细胞百分比(SPF),分析了这些参数与肿瘤组织学分级、临床分期和淋巴结转移之间的关系,以探讨它们在临床上的应用价值和实际意义。1材料与方法1.1临床资料1997至1998年山东医科大学附属医院收治喉鳞状细胞癌24例,患者术前均未经任何治疗,取术后新鲜肿瘤标本,送流式细胞仪检查,并由本院病理科确定其病理类型和分化程度。喉癌24例均为鳞状细胞癌;病理分

8、化程度是高分化6例,中分化6例,低分化12例,将高、中分化鳞癌并为1组,共12例。按1987年UICC标准进行临床分期,期2例,期4例,期10例,期8例,将、期合并为早期组,共6例,、期合并为晚期组,共18例,经病理证实淋巴结有无转移,转移组8例,非转移组16例。24例中,男20例,女4例,男3772岁,平均57岁,女5060岁,平均59岁。1.23的新鲜组织块,用机械法制备单细胞悬液。用剪刀将组织块剪至匀浆状加入生理盐水,低速离心2次(800r/min),去除细胞碎片,用200目尼龙网过滤,70%冰乙醇固定,放置04冰箱备检;(2)DNA含量的检测取出制备好的单细胞悬液,弃固定剂,用PBS洗

9、2次,调制106细胞数的单细胞悬液加入PI染色液1.0ml(内含PI50g/ml,RNA酶50g/ml)30min后上机分析。选用正常人淋巴细胞作为正常二倍体DNA对照标准,调节变异系数(coefficient of variation,CV)5%;(3)结果判定流式细胞仪测得数值经计算机软件处理,显示细胞DNA含量直方。因单纯从直方判断,易受Go/G1峰出现的位置及G2/M峰比例的影响。为准确判断,依据定量指标DNA指数(DI)判定2,DI=1.0±0.1为二倍体,DI=1.0±0.15为近二倍体,DI=2.0±0.1为四倍体,DI2.10为多倍体,余为非整倍体

10、。判定结果时,将近二倍体、四倍体、多倍体和非整倍体均划归异倍体。流式细胞仪可同时测量肿瘤细胞S期比例(SPF),SPF=S/(G0G1）S（G1M）×100%。1.3统计学方法肿瘤细胞DNA异倍体与肿瘤组织学分级、临床分期、淋巴结转移关系对比用2检验,DI和SPF与肿瘤组织学分级、临床分期、淋巴结转移关系对比用t检验。由于本研究样本较少,2检验用直接概率法计算P值,t检验采用校正t检验。P0.05为差异有显著意义,P0.01为差异有高度显著意义。2结果2.1DNA含量与组织学分级的关系见表1。表1DNA含量与组织学分级的关系组织学分级n异倍体二倍体DI(±s)SPF(

11、77;s)n%n%高中分化鳞癌低分化鳞癌121281266.671004033.331.27±0.26?1.35±0.1915.04±6.32?18.95±16.87?*P0.05 24例中,高中分化鳞癌12例,低分化鳞癌12例,异倍体分别为8例(66.67%)和12例(100%),异倍体率呈增高趋势,但统计学上差异无显著性。高中分化鳞癌的DI和SPF与低分化鳞癌的差异无显著性(P0.05)。2.2DNA含量与临床分期的关系见表2。表2DNA含量与临床分期的关系临床分期n异倍体二倍体DI(±s)SPF(±s)n%n%、期、期61841

12、666.6788.892233.3311.111.16±0.101.36±0.23?6.25±5.420.58±12.35?*P0.05*P0.01 24例中,早期肿瘤(、期)6例,晚期肿瘤(、期)18例,其异倍体分别为4例(66.67%)和16例(88.89%),异倍体率呈增高趋势,但差异无显著性(P0.05)。晚期肿瘤DI高于早期肿瘤,差异有显著性(P0.05)。晚期肿瘤SPF高于早期肿瘤,差异有高度显著性(P0.01)。2.3DNA含量与淋巴结转移的关系见表3。表3DNA含量与淋巴结转移的关系淋巴结n异倍体二倍体DI(±s)SPF(

13、77;s)n%n%非转移组转移组1681287510040251.30±0.241.33±0.2111.92±7.9827.15±14.50*P0.05 24例中颈部无淋巴结转移16例,淋巴结转移8例,其异倍体分别为12例(75%)和8例(100%),异倍体率呈增高趋势,但差异无显著性(P0.05)。转移组DI与非转移组比较,差异无显著性(P0.05),转移组SPF高于非转移组,差异有显著性(P0.05)。3讨论恶性肿瘤的发生是一个多因子、多步骤的复杂生物学过程,肿瘤细胞的特点包括细胞的无休止和无序分裂增殖,并具有侵袭性和转移性,其基本变化是细胞DNA发

14、生变异,近年,肿瘤细胞DNA的研究和测定已成为热点。3.1DNA含量测定概述1953年Watson和Crick阐明了DNA的分子结构,分子生物学时期从此开始。学者们研究发现,某些疾病的发病机理与DNA的变异有关,并逐渐认识到肿瘤细胞的基本生物学特征表现为细胞的增殖和分化调控的失调,细胞DNA与恶性肿瘤发生、发展密切相关。肿瘤细胞DNA一般有以下特点:(1)出现异倍体或多倍体,DNA异倍体是恶性肿瘤的重要标志之一;(2)DNA含量多有不同程度的增高;(3)DNA合成期细胞比例增加,说明细胞增殖多。DNA含量测定与肿瘤形态学研究相结合会进一步提高人们对肿瘤恶性生物学行为的认识水平。用流式细胞术可对

15、新鲜肿瘤组织或石蜡包埋组织行DNA参数测定,但后者与前者相比,有以下不足:(1)样品中的碎片较多,DNA组方质量不及新鲜组织好,组方的细胞峰较宽,细胞峰CV值较大;(2)异倍体率减少,由于组方的细胞峰CV值增大,一些接近于二倍体的DNA异倍体峰位被掩盖;(3)S期细胞百分数不如新鲜组织的S期计算准确;(4)DNA二倍体标准不稳定。我们用新鲜肿瘤组织制备单细胞悬液,通过流式细胞仪测得的数据可靠、准确。3.2流式细胞仪在恶性肿瘤临床实践中的应用通过流式细胞仪DNA分析,异倍体、肿瘤细胞增殖异常、SPF等指标在许多常见的恶性肿瘤中,与肿瘤的重要生物学特性密切相关,这些指标与肿瘤临床分期、组织学分级相

16、比有着独立的特性,通过研究,证实它们在某些肿瘤中可作为临床肿瘤预测的重要指标3。Tribukait等4用流式细胞仪对膀胱癌DNA含量进行研究,回顾性或前瞻性研究均证实DNA倍体与肿瘤的组织学分级、生物学行为及预后密切相关。I级乳头状肿瘤多为二倍体,而级肿瘤、非乳头状肿瘤、侵袭性肿瘤多为异倍体,级肿瘤一半为二倍体,一半为异倍体。二倍体膀胱癌如果复发,一般不发生外侵或远处转移,而异倍体膀胱癌复发,易发生外侵和远处转移。证实膀胱癌DNA倍体与组织学分级、临床分期所提示的肿瘤外侵和转移特性相关。Auer等5最先对乳腺癌患者DNA倍体进行回顾性研究,将患者分为4组,I组为二倍体肿瘤组,组为四倍体肿瘤组,

17、组为四倍体和二倍体混合组,组为多倍体肿瘤组,结果组患者10年生存率明显高于组,而、组的生存率和肿瘤的恶性行为介于、组之间。Olszewski6研究发现,乳腺癌二倍体肿瘤的雌激素受体(ER)阳性率比异倍体肿瘤高,预后好于异倍体肿瘤,而在异倍体肿瘤中,高SPF与高复发率和高死亡率相关,且SPF与肿瘤组织学分级也有很强的相关性,认为在临床实践中,应将异倍体和SPF做为重要参考指标。3.3DNA含量与头颈部鳞状细胞癌的关系头颈部鳞状细胞癌DNA含量的流式细胞仪研究分析资料尚不多,以往的资料显示,头颈部鳞癌的异倍体发生率大约是57%86,平均66%。Stell7通过对头颈鳞癌的分析,认为其DNA含量与病

18、理分级密切相关,高分化肿瘤组异倍体率为37%,低分化组则为64%,差异有高度显著性。Costello8认为,单纯分析异倍体,、期头颈鳞癌的异倍体检出率高于、期患者,但统计学上无显著性差异,进一步分析DI,发现、各期肿瘤DNA指数之间,差异有显著性,表明单纯从倍体特性直接研究它与临床分期之间的关系,有时不能反映其内在联系,只有进一步研究DI与临床分期的关系,才能揭示其内在规律。Kokal9对76例头颈鳞癌进行多项指标分析,发现DNA倍体与头颈鳞癌的临床分期和淋巴结转移有关,认为DNA倍体在预测复发率和生存率方面有重要的临床意义,而且是预测手术切除肿瘤后患者生存率最重要的预后变量。近年通过流式细胞

19、仪测定头颈鳞状细胞癌DI和SPF发现,DI和SPF能更准确地反映头颈鳞癌的生物学特点和恶性行为。John10通过对88例未行治疗的喉鳞状细胞癌分析,DI与其侵袭性、淋巴结转移、复发率和生存期有关,他认为,DI可作为独立变量,对肿瘤复发和预后进行估测,比传统分期更有意义。Gomez11发现SPF与肿瘤的大小、组织学分级、淋巴结转移、临床分期有关,是最有力的肿瘤预测指标之一。Johnson12分析了DI和SPF与头颈鳞癌的关系,认为DI和SPF与肿瘤的恶性程度、侵袭性、淋巴结转移和预后相关。我们利用流式细胞仪定量分析24例喉鳞状细胞癌,其异倍体检出率为83.3%(2024）,表明流式细胞仪对新鲜肿

20、瘤标本DNA倍体检出率较高。我们发现随着肿瘤分化程度降低,临床分期增高,淋巴结出现转移时,异倍体率呈增高的趋势,但统计学无显著差异,也可能与本研究样本较小有关。本研究显示,DI与喉鳞状细胞癌临床分期有关,晚期肿瘤组(、期)DI值高于早期肿瘤组(I、期)(P0.05),而DI与组织学分级和淋巴结转移无关。DI值高,则DNA倍体变异程度大,晚期肿瘤DNA异倍体或多倍体出现的比率高,DNA含量高,肿瘤恶性行为增强。本研究显示,SPF与喉鳞状细胞癌临床分期和淋巴结转移有关。晚期肿瘤组(、期)SPF高于早期肿瘤组(I、期)(P0.01),淋巴结转移组SPF高于非转移组(P0.05)。SPF与喉鳞状细胞癌

21、组织学分级无关。SPF表示S期细胞增殖百分比,SPF高则S期细胞增殖活跃,肿瘤增殖活性增强,DNA合成增加,肿瘤细胞无限制、无休止增殖的细胞数量不断地增多,则恶性肿瘤外侵、转移的生物学行为强烈。综上所述,可得出以下结论:(1)本组喉鳞状细胞癌异倍体检出率为83.3%,表明DNA异倍体是喉鳞状细胞癌的重要特征之一;(2)本研究显示DI与喉鳞状细胞癌临床分期有关(P0.05)。SPF与其临床分期有关(P0.01);SPF与其淋巴结转移有关(P0.05)。通过流式细胞仪对喉鳞状细胞癌进行DNA定量测定,其DI、SPF可作为判断喉鳞状细胞癌生物学特性的重要指标。作者单位：杨秋安赵维萍山东医科大学附属医

22、院,250012钱哨济南妇幼保健院,250001参考文献1Ciancio G,et al.Flow cytometric analysis of DNA and nuclear protein in paraffin-embedded tissue.Cytometry,1993;14:2052Merkel DE,et al.Ploidy,proliferative activity and prognosis,DNA flow cytometry of solid tumors.Cancer,1990;65:11943Mekel DE,et al.Flow cytometry,cellular

23、 DNA content and prognosis in human malignancy.J Clin Oncol,1987;5:16904Tribukait B.Flow cytometry in assessing the clinical aggressiveness of genito-urinary neoplasms.World J Urol,1987;5:1085Auer GU,et al.DNA content and survival in mammary carcinoma.Anal Quant Cytol,1980;2:1616Olszewski W,et al.Flow cytometry of breast carcinoma.Relationship of DNA ploidy level to histology and estrogen receptor.Cancer,1981;48:9807Stell PM.Ploidy in head and neck cancer:A r