毛豆腐的毛霉发酵与其提取物的体外ACE抑制活性

1、杭 梅，赵新淮*( 东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030)摘 要:利用分离得到的 1 株毛霉发酵豆腐制备毛豆腐。采用 20% 、40% 、60% ( v / v) 乙醇溶液作为提取溶剂，对发酵时间为 3、5、7、9d 的毛豆腐样品进行提取，测定提取物中可溶性蛋白质的提取率、水解度，以及提取物的体外 ACE 抑制 活性。研究结果表明，随着毛豆腐发酵时间的延长，提取物中可溶性蛋白质提取率、水解度逐渐增加; 毛豆腐发酵第 5d 时，60% ( v / v) 乙醇溶液提取物的 ACE 抑制活性最高，并且其氨基酸组成分析结果表明，60% ( v / v) 乙醇溶液提取物中 总

2、疏水性氨基酸和脯氨酸的量最多。关键词:毛霉，毛豆腐，乙醇提取物，ACE 抑制活性Fermentation of Mao tofu by Mucor spp.andACE inhibitory activity of its extracts in vitroHANG Mei，ZHAO Xin huai*( Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)Abstract: Commercial tofu was fermente

3、d with a strain of Mucor to prepare Mao tufu.Mao tofu samples fermentedfor 3，5，7，9 days were extracted by three ethanol solutions with ethanol contraction of 20% ，40% and 60% ( v / v) ， respectively.The extraction yield and degree of hydrolysis of the soluble protein fractions in the extracts were a

4、nalyzed.The ACE inhibitory activity of the extracts was also evaluated in vitro.The results showed that the longer the fermentation time of Mao tofu samples，the higher extraction yield and degree of hydrolysis of the soluble protein fractions in the extracts.When Mao tofu sample was fermented for 5

5、days，its extract of 60% ( v / v) ethanol solution showed the highest ACE inhibitory activity. Meanwhile，the amino acid compositions obtained indicated that the extract of 60% ( v / v) ethanol solution had the highest amount of total hydrophobic amino acids and proline. Key words: Mucor spp.; Mao tof

6、u; ethanol extracts; ACE inhibitory activity中图分类号:TS201.3文献标识码:A文 章 编 号:10020306(2011)11018704中含有 ACE 抑制活性肽10 。我们曾经研究过毛豆腐发酵过程中主要成分、微细结构等的变化11 ，并确 定了毛霉产蛋白酶的适宜发酵条件12 ，并未评价毛 豆腐中蛋白质的生物活性，不能确定毛霉发酵是否 能够使得毛豆腐提取物具有 ACE 抑制作用。为此， 根据过去的工作基础，本研究利用以前分离得到的 1 株毛霉菌种，实验室发酵制备毛豆腐样品，然后利用3 种组成比例不同的乙醇水溶液为提取剂，对发酵时 间不同的毛豆腐

7、样品分别进行提取，分析各种提取 物中蛋白质组分的含量及其水解度大小，然后测定 其体外的 ACE 抑制活性，最后对具有最高活性的提 取物进行氨基酸组成分析。近年来，人们对具有预防或治疗某些疾病的食品成分产生了兴趣12 。大豆发酵制品具有某些较 好的 生 理 功 能，诸 如 抗 癌、抗 氧 化、抗 菌 和 降 血 压 等3 。大豆发酵制品的降血压功能，主要源于其中所 含有的血管紧张素转换酶( ACE ) 抑制肽，这类肽已 从许多大豆制品中提取并被研究1，45 。毛豆腐是我 国徽州的著名小吃6 ，是利用微生物发酵豆腐所制成 的发酵食品，可以有效地提高大豆的消化率和生物 价7 。毛霉是生产毛豆腐的主要

8、菌种。毛霉能分泌 蛋白酶，将蛋白质分解生成氨基酸和多肽等，使食品 具有独特的风味和细腻的质地。毛豆腐的制作工艺 与腐乳相似，而关于腐乳的降血压功能已有多个研 究报告。已有研究者研究日本腐乳和中国腐乳的 ACE 抑制活性89 。倪莉认为，在腐乳的水溶性成分材料与方法材料与设备豆腐 购自哈尔滨市市场; 毛霉( Mucor)11.1从民间自然发酵生产的毛豆腐中分离获得; 兔肺丙酮粉、收稿日期:20110801 * 通讯联系人作者简介:杭梅( 1984 ) ，女，在读硕士研究生，研究方向: 食品科学。FAPGG( FA Phe Gly Gly)Sigma 公司; 其它所用187试剂为分析纯试剂，所用水

9、为蒸馏水。UV2401PC 型紫外可见分光光度计 日本岛津 公司; AL204 型分析天平 梅特勒 托利多仪器中国 有限公司; Kjeltec TM2300 型自动凯氏定氮仪 瑞士 Foss 公司; DHP9272 型电热恒温培养箱 哈尔滨东 联电子技术开发有限公司; 手提式压力蒸汽灭菌器 镇海金鑫医疗器械有限公司; H 1 型微型漩涡混 合器、DS1 高速组织捣碎机 上海精科实业有限公 司; YH4BS 型远红外恒温干燥箱 天津市中环实验 电炉有限公司; DK 98 1 型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司。1.2 实验方法ACE 酶液: 称取 50mg 兔肺丙酮粉浸泡于 5mL预冷至

10、 4 的硼酸缓冲溶液( pH 8.3，100mmol / L) 中， 悬液放入 4 恒温震荡摇床中提取 12h，20000r / min 冷冻离心 20min，上清液于 4 低温保存。FAPGG 底 物 溶 液: 将 FAPGG 溶 于 100mmol / L 的硼酸缓冲溶液( pH8.3，含 300mmol / L 的 NaCl) ，配 制成 1.6mmol / L 的溶液。ACE 抑制活性测定: 500L FAPGG 底物溶液与100L 超纯水或提取物混 匀，37 预 热 2min，加300L ACE 酶液并在 37 反应 30min，立即加 100L EDTA( 100mmol / L)

11、 终止反应; 加 4000L 超纯水稀 释，平行 3 次。0min 样品的测定，先加入 EDTA 再加 入 ACE 酶液，其他相同。分光光度计 340nm 处波长 分别测体系在 0min 和 30min 时的吸光值，计算差值 A( A = A0min A30min ) 。以单位时间内吸光值变化表示 ACE 酶活力，提 取 物 对 ACE 酶的抑制程度按下式 计算:毛豆腐制作取市售的豆腐，将豆腐切块为1.2.16cm × 6cm × 4cm 大小，121 灭菌 30min 后，稍风干除去水滴，然后摆放在竹笼内，豆腐块之间应保持一 定距离，以利于发酵。预先将毛霉制成菌悬液，用毛

12、刷将菌悬液均匀 涂于各表面，用纱布将竹笼覆盖好后送入培养箱。培养箱温度控制在 20 。发酵过程中，豆腐表 面出现白色绒毛并形成菌膜; 发酵后期豆腐软化并 有毛豆腐特有的香气。在发酵时间为 3、5、7、9d 时， 随机取出若干样品，进行提取与分析。= ( 1 Ai ) × 100%ACE 抑制活性( % )Ac式中: Ac ，加入超纯水时吸光值在 30min 内的变化; Ai ，加入提取物时吸光值在 30min 内的变化。 氨基酸组成分析 采用氨基酸自动分析仪 进行分析。毛豆腐水分与总蛋白质的测定数据处理采用 SPSS 13.0 软件对数据进行处理和分析。

13、结果与讨论采 用 105 烘 干 法13 。 平 行 水 分 测 定3 次。 总蛋白质测定 采用凯氏定氮法14 。将毛豆腐样品在 121 灭酶 30min，取出冷却，除去菌膜后 用高速组织捣碎机捣碎。取一定质量的样品进行凯 氏定氮分析，计算总蛋白质含量，换算系数为 5.71。 平行 3 次。22.1 毛豆腐发酵过程中主要成分组成的变化毛豆腐发酵过程中，因为水分的自然蒸发而损 失一部分水分( 由 84.5% 降至 73.6% ) ，这样就导致 毛 豆腐的蛋白质含量随之增加 ( 由 8.1% 增 至14.3% ) 。这些变化趋势如图 1 所示，并与以前的研 究结果11

14、一致。1.2.3 毛豆腐的提取及蛋白质提取率测定取 75g毛豆腐，分别与 20% 、40% 、60% ( v / v ) 乙醇溶液混合，定容到 250mL，高速组织捣碎机中 12000r / min 捣 碎 1.5min，离心机中 5000r / min 离心 15min，分离上清 液得到毛豆腐提取物。提取物中的乙醇通过旋转蒸 发除去，然后定容至原体积。各个提取物和毛豆腐 样品分别进行凯氏定氮分析，计算蛋白质提取率。 平行 3 次。蛋白质提取率( % )= 上清液中蛋白质含量( mg / mL)× 100%总蛋白质含量( mg / mL)图 1 毛豆腐毛霉发酵过程中水分与总蛋白质含量

15、变化提取物的分析方法游离氨基含量与蛋白质水解度 蛋白质含.4.12.2毛豆腐提取物的蛋白质提取率和水解度毛豆腐在被毛霉发酵不同时间后，利用乙醇浓量测定参照凯氏定氮法14 。提取物游离氨基含量与蛋白质水解度( DH) 测定参照 OPA 法1516 。水解度计算公式如下:DH ( % ) = 提取物游离氨基含量( mol / mL) /5.71 × N1 ( mg / mL ) 0.35 ( mmol / g) /7.8 ( mmol / g )× 100%式中: 5.71，大豆蛋白质的换算系数; 0.35mmol / g， 大豆蛋白质的游离氨基含量; 7.8m

16、mol / g，大豆蛋白质 的肽键含量; N1 ，提取物的氮含量，mg / mL。度不同的 3 种乙醇溶液提取其中的可溶性蛋白质组分。所提取出的蛋白质组分的提取率和水解度如表1 所示。数据表明，随着毛霉发酵时间的延长，毛豆 腐提取物中蛋白质的提取率与水解度均呈现增加的 趋势，尤其是蛋白质组分的提取率从 6.0% 以下增加 至 31% 以上。这说明发酵过程中毛霉所分泌的蛋白 酶，充分地降解了豆腐中的大豆蛋白质; 发酵时间延 长，毛霉分泌蛋白酶的水解作用增加，使其水解度增 加，同时也增加了其在提取溶剂中的溶解性，导致可 溶性蛋白质的提取率增加。毛豆腐发酵 9d 时，无论ACE 抑制活性 以 FAP

17、GG 为底物，采用非连续分光光度法测定样品的 ACE 抑制活性1718 。188表 1 不同发酵时间毛豆腐提取物的可溶性蛋白质提取率和水解度发酵时间( d)指标提取溶剂 0 3 5 7 9 20% 乙醇溶液40% 乙醇溶液60% 乙醇溶液20% 乙醇溶液40% 乙醇溶液6.1 ± 1.0B( a)5.0 ± 0.6AB( a)3.7 ± 0.1A( a)17.4 ± 0.6A( a)17.7 ± 0.9A( a)20.9 ± 0.8A( b)18.7 ± 2.0A( b)16.7 ± 2.9A( b)

18、22.8 ± 0.9A( b)23.5 ± 0.8AB( b)24.9 ± 1.5B( c)22.9 ± 1.6AB( c)20.3 ± 0.3A( bc)23.8 ± 0.5A( b)24.8 ± 0.8AB( b)28.7 ± 0.6C( d)25.6 ± 1.0B( c)23.1 ± 0.7A( c)32.1 ± 0.7A( c)32.4 ± 1.5A( c)35.3 ± 0.8B( e)32.9 ± 0.3AB( d)31.7 ± 1.3

19、A( d)38.5 ± 0.1AB( d)38.3 ± 1.2A( d)提取率( % )水解度( % ) 60% 乙醇溶液18.2 ± 0.5A( a) 25.9 ± 0.4B( b) 26.3 ± 0.2B( b) 33.8 ± 1.5A( c) 40.9 ± 0.5B( d) 注: 采用 Duncans 多重比较。同一行中，同一指标数值后标相同小写字母表示组内分析结果差异性不显著，反之差异性显著( P 0.05) 。同一列中，同一指标数值后标相同大写字母者表示组间分析结果差异性不显著，反之差异性显著( P 0.05) 。

20、表 2 同。表 2 不同发酵时间毛豆腐提取物的 ACE 抑制活性( % )发酵时间( d)提取溶剂 3 5 7 9 20% 乙醇溶液40% 乙醇溶液 60% 乙醇溶液16.1 ± 2.1AB( a)18.0 ± 1.6B( a)22.5 ± 2.7AB( b)25.9 ± 2.6B( b)15.7 ± 2.1A( a)17.3 ± 1.2A( a)13.9 ± 1.3A( a)14.5 ± 2.7AB( a)22.1 ± 2.7C( b) 32.0 ± 1.7C( c) 20.9 ±

21、1.7B( ab) 16.7 ± 2.6AB( a) 采用何种提取溶剂，可溶性蛋白质的提取率和水解度均最大。提取溶剂中乙醇含量不同( 即极性不同) ，影响 毛豆腐 提 取 物可溶性蛋白质的提取率与水解 度。60% ( v / v) 乙醇溶液的极性最低，提取物中的可溶性 蛋白质最少、提取率最低，但是水解度相对最大。而20% ( v / v) 乙醇溶液的极性最高，提取物中的可溶性 蛋白质最多、提取率最高，但是水解度相对最小。另 外，发酵 3d 后，所有提取物中蛋白质组分的水解度 在 22% 以上，说明蛋白质组分是大豆蛋白的降解产 物肽而非大豆蛋白质。为，N 端为疏水性的缬氨酸、亮氨酸、异

22、亮氨酸或碱性氨基酸的肽，与 ACE 的亲和力较强，所以其抑制活性 较高20。这些结论支持了表 3 中的数据和前述的提 取物 ACE 抑制活性差异，即毛豆腐提取物的脯氨酸含 量高、总疏水性氨基酸多，其 ACE 抑制活性就高。表 3 毛豆腐发酵第 5d 时提取物的氨基酸组成( mol，% )20% 乙醇溶液提取物40% 乙醇溶液提取物60% 乙醇溶液提取物氨基酸AlaArg Asp Cys Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Tyr Val总疏水性 氨基酸7.824.2512.090.6828.734.554.730.73

23、3.076.604.403.601.464.5232.208.703.9411.890.6028.198.831.123.274.444.420.743.086.754.343.551.464.68010.640.6825.168.571.063.504.894.330.933.0910.684.384.671.753.9637.00毛豆腐提取物的 ACE 抑制活性对毛豆腐提取物的 ACE 抑制活性进行测定，固 定测定样品的蛋白质浓度为 0.5mg / mL，结果如表 2所示。数据表明，发酵时间与提取溶剂组成对提取物的 ACE 抑制活性有影响。在同一发酵时间，60%(

24、v / v) 乙醇溶液提取物的 ACE 抑 制 活 性 最 高，而20% ( v / v) 乙醇溶液提取物的 ACE 抑制活性最低; 从发酵时间的影响来看，发酵第 5d 时得到的提取物 具有最高抑制活性; 整体上看，发酵时间为 5d、60%( v / v) 乙醇溶液提取物具有最高的 ACE 抑制活性。 这些结果表明: 豆腐经过毛霉发酵后，其蛋白质被降 解，生成对 ACE 具有抑制作用的肽，使得毛豆腐提取 物对 ACE 的抑制作用加强。也就是说，毛霉发酵可 以赋予豆腐以更好的 ACE 抑制作用。2.32.4发酵 5d 的毛豆腐提取物的氨基酸组成对发酵 5d 的毛豆腐提取物的 17 种氨基酸的摩注

25、: 总疏水性氨基酸为 Ala + Val + Leu + Ile + Phe + Pro + Tyr+ Met 的总和。3结论利用 1 株毛霉对豆腐进行发酵获得毛豆腐，利尔数百分组成进行分析，测定、计算出的结果如表 3所示。从表 3 中数据可以看出，60% ( v / v) 乙醇溶液提 取物的总疏水性氨基酸最多( 37.00% ) ，20% ( v / v) 乙 醇溶液提取物的总疏水性氨基酸最少( 32.20% ) 。另 外，60% ( v / v) 乙醇溶液提取物中的亮氨酸、异亮氨 酸、甲硫氨酸、脯氨酸，尤其是脯氨酸，明显地高于其 他提取物。普遍认为疏水性氨基酸在 ACE 抑制肽中 起重要作

26、用。Cheung 等人发现，ACE 抑制肽的活性主 要取决于 C 端氨基酸，C 端氨基酸为芳香族氨基酸和 脯氨酸时，其抑制活性较高19。另外，Megías 等人认用 3 种乙醇溶液( 20% 、40% 、60% ，v / v) 对发酵时间为 3、5、7、9d 的毛豆腐样品进行提取，获得可溶性蛋 白质提取物。分析表明，提取物中可溶性蛋白质的 提取率、水解度均随着发酵时间的增加而增加; 60%( v / v) 乙醇溶液提取物中的可溶性蛋白质最少、提取 率最低、水解度最大，20% ( v / v) 乙醇溶液提取物中 的可溶性蛋白质最多、提取率最高、水解度最小。同 时，发酵 时 间与提取溶剂

27、组成对毛豆腐提取物的 189ACE 抑制活性有影响，发酵时间为 5d、60% ( v / v) 乙醇溶液提取物具有最高的 ACE 抑制活性，并且氨基 酸组成分析结果显示，60% ( v / v) 乙醇提取物的脯氨 酸( Pro) 、总疏水性氨基酸最多。豆腐经过毛霉的发 酵，赋予其更好的 ACE 抑制作用。参考文献( Fermented Tofu ) extracts J. Jpn Agric Res Quart，2003，37( 2) : 129 132.10倪莉，饶平凡，王璋 .腐乳中生理活性多肽的分离和表征J.浙江农业大学学报，1997，23( 5) : 9397.11郑晓婷，赵新 淮 .

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37、檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾( 上接第 186 页)9 Tedersoo L，Suvi T，Jairus T，et al. Revisiting ectomycorrhizalfungi of the genus Alnus: differential host specificity，diversity and determinants of the fungal community J. The New Phytologist，2009，182( 3) : 727735.10 White T J，Bruns T，Lee S，et al. Amplification and direct sequencing of