金丝桃素调节病毒性心肌炎小鼠体内细胞因子的分泌

1、金丝桃素调节病毒性心肌炎小鼠体内细胞因子的分泌 李 乐1 高小利2 丁宝兴2 （1浙江工业大学药学院，浙江 杭州 310014；2西安医科大学药理教研室，陕西 西安 710061）摘要 目的：利用小鼠病毒性心肌炎模型，观察金丝桃素对病毒性心肌炎小鼠体内细胞因子作用的影响，探讨药物治疗的作用机制，为其临床应用提供实验依据。方法：以Coxsaekie B3型病毒感染10日龄小鼠制备心肌炎模型，在感染后不同时期，测定脾细胞加ConA诱导培养和心肌组织培养上清液中的IL-2及TNF-的含量；采用微量细胞病变法检测血清中IFN的活性水平。结果：金丝桃素促进感染小鼠体内诱生IFN；调节感染后不同阶段的IL

2、-2分泌；抑制TNF-的产生结论：金丝桃素对病毒感染机体细胞因子的分泌具有调节作用关键词 金丝桃素 病毒性心肌炎 IL-2；TNF-; IFNModulation of hypericin on the cytokines secretion of mice with viral myocarditis Li le1 ，Gao Xiao-Li2，Ding Bao-Xing2 （1.School of Pharmacy , ZheJiang University Of Technology. HangZhou 310014,China; 2.Department Of Pharmacology,

3、 Xi-an Medical university, Xi-an 710061,China )Abstract OBJECTIVE: Using the model of mice with viral myocarditis to elucidate the effect of hypericin on the cytokines in mice with viral myocarditis. METHODS: Methods Ten-day mice were infected with Coxsaekie B3 virus to make the myocarditis model，IL

4、-2 and TNF- contents in cultured spleen cells added ConA and supernatant of cultured cardiomyocytes were measured during the different phase.IFN activity in serum was determined by Microcytes pathological change test.RESULTS: hypericin facilitated the IFN production in the Coxsaekie B3 virus infecte

5、d mice,modulate IL-2 secretion during the different phase and inhibited the TNF- production.CONCLUSION: Hypericin could modulate the cytokines secretion of mice viral myocarditis.Key Words: hypericin; viral myocarditis; IL-2；TNF-; IFN中图分类号：R542 文献标示码：A 文章编号：病毒性心肌炎(viral myocarditis ,VM) 是由亲心肌病毒感染所致的

6、以心肌炎症病变为主的疾病。其机制一直未明了，尚无满意的治疗方法。引起心肌炎的病毒以柯萨奇B组病毒(Coxsackievirus group B,CVB)较为常见1。近年来干扰素（IFN）、肿瘤坏死因子（TNF-）、白细胞介素-2（IL-2）等细胞因子在心肌炎发病中的作用备受关注2。金丝桃素(Hypericin) 是从贯叶连翘中提取的具有光敏活性和光动力作用的萘骈二蒽酮化合物，能对抗多种逆转录病毒3；我们的研究表明，金丝桃素具有明显抗CVB3复制和心肌细胞保护作用（另文发表）。本实验在小鼠心肌炎模型上，通过对IFN，TNF-，IL-2等细胞因子的影响，探讨金丝桃素可能治疗VM作用的机制所在，研究

7、结果报告如下：材料与方法1.1 材料 金丝桃素购于Sigma 公司;利巴韦林(ribavilin)注射液为浙江亚太药业有限公司产品，批号：0105123；Balb/c小鼠，体重16-21g,购自西安医科大学实验动物中心，病毒：感染病毒为Coxsaekie B3嗜心肌病毒(CVB3)，TCID50为109·L-1；攻击病毒为滤泡性口炎病毒(VSV)，TCID50为108·L-1；小鼠成纤维细胞（L929），按常规方法传代，RPMI1640培养基培养，实验时按所需调配细胞浓度；小鼠TNF-，IL-2 ELLSA试剂盒为法国ACoulter公司产品。1.2 病毒感染与分组给药方法

8、 实验分为：正常小鼠对照组；病毒对照组；利巴韦林阳性治疗组；金丝桃素治疗设5 mg·kg-1组；15 mg·kg-1组；4O mg·kg-1组；每组15只,实验当日，每只小鼠腹腔内接种0.3 mL内含105CVB3RPMI-1640液接种2 h后，金丝桃素各组小鼠以5 mg·kg-1；15 mg·kg-1；4O mg·kg-1体重、2次·d-1灌胃给药；利巴韦林组小鼠以100 mg·kg-1体重皮下注射，1次·d-1；病毒对照组小鼠以等体积的消毒生理盐水用药，2次·d-1；正常对照组小鼠不做任何

9、处理，自然喂养连续治疗至急性期5d时，每组随机杀检13(5只)小鼠，进行IFN，TNF-a和IL-2测定。余23小鼠继续接受治疗至10，20 d杀检，重复上述检测1.3 细胞因子测定4 IFN的测定：采用微量细胞病变抑制法，各组小鼠血清作系列倍比稀释，取01mL分别加入96孔培养板，再按此量加入2×106·mL-1L929细胞，37，5C02培养24h，以200TCID50VSV攻击，48 h内观察细胞病变，用Reed-Muench法计算结果。IL-2、TNF-a的测定：各组小鼠脾脏用RPMI-1640培养液制备细胞悬液，调配成5×105·mL-1个细胞

10、;心脏称重，加入RPMI-1640培养液制成细胞悬液,具体步骤按相关试剂盒说明书操作。14 统计分析 实验数据用均数±标准差(±s)表示，组间差异用方差分析。 2 结果 21 金丝桃素对心肌炎小鼠体内IFN活性的影响 在急性期不同阶段(5，10，20d)，金丝桃素不同剂量组有促进心肌炎小鼠体内IFN诱生的作用，金丝桃素的IFN诱生水平多高于利巴韦林组；与病毒对照组比较，差别显著；见表1表1金丝桃素对CVB3心肌炎小鼠体内干扰素诱生水平的影响(±s)Table 1. Effect of hypericin on the IFN activity in mice wi

11、th CVB3 myocarditis(±s)_Groups n dose IFN titre（U·0.1-1 mL) _ mg·Kg-1 5 d 10 d 20 d_Normal mice 15 5.6±0.7 3.4±0.5 3.3±0.7Virus 15 26.2±5.4 9.7±1.1 4.4±0.2ribavilin 15 100 31.9±5.5* 15.2±3.5* 6.6±2.3*Hypericin 15 5 28.3±2.6 19.5±2

12、.8* 8.4±1.5*Hypericin 15 15 36.7±5.3* 25.4±3.4* 10.6±5.8*Hypericin 15 40 42.8±2.6* 30.3±_与病毒对照组比较，*P<O.05,*P<0.O1.Compared with Virus group, *P<O.05,*P<0.O1.22 金丝桃素对心肌炎小鼠体内IL-2因子水平的影响 在病毒感染早期(5 d)时，感染病毒的各组IL-2因子水平均比正常小鼠组高，而治疗组的IL-2因子水平则又高于病毒对照组;到感染中期时(10 d)，

13、病毒对照组的IL-2因子分泌水平上升，明显高于各药物治疗组(P<0.01)。至急性期恢复期时(20 d)，与病毒对照组比较(P<005),金丝桃素组IL-2因子水平值仍处于低值状态。表明金丝桃素对感染病毒的小鼠在急性期时心肌炎性病变产生、发展过程中，对IL-2因子的分泌具有调节作用(表2)表2.金丝桃素对CVB3心肌炎小鼠脾细胞诱生IL-2的影响(±s)Table 2. Effect of hypericin on the spleen cell induced IL-2 content in mice with CVB3 myocarditis(±s)_gro

14、ups n dose IL-2(pg·0.1mL-1) _ mg·Kg-1 5 d 10 d 20 d_ Normal mice 15 124.6±10.3 93.6±25.7 126.7±22.9Virus 15 134.1±11.5 161.4±24.1 148.2±16.2ribavilin 15 100 142.1±16.1* 131.3±37.3* 143.7±21.5Hypericin 15 5 138.1±8.7 126.0±44.1* 132.7&#

15、177;32.1*Hypericin 15 15 141.9±10.9* 130.2±23.4* 136.1±38.5*Hypericin 15 40 146.5±9.8* 139.1±23.3* 137.6±40.1*_与病毒对照组比较 *P<0.05, *P<O.01。Compared with Virus group, *P<0.05, *P<O.01。 23 金丝桃素对心肌炎小鼠体内TNF-a水平的影响 心肌组织中的TNF-a在感染病毒后第5天，均有明显增加与病毒对照组比较，服用金丝桃素可降低心肌中TN

16、F-a的含量其抑制作用在感染10 d期时最明显(P <0.05)，并持续至20d(P <0.05)利巴韦林对TNF-a的影响变化较大，早期时的含量为病毒对照组的2倍多，中后期时下降(表3)表3 金丝桃素对CVB3感染小鼠心肌中TNF-a的影响(±s)Table3. Effect of hypericin on TNF-a content of cardiomyocytes in mice with CVB3 myocarditis(±s)_groups n dose TNF-a (pg·0.1-1mL) _ mg·Kg-1 5 d 10 d

17、20 d_ Normal mice 15 一 17.6±5.8 14.9±5.3 27.5±3.2Virus 15 71.9±7.7 54.4±2.1 61.7±2.3ribavilin 15 100 159.7±11.1* 46.1±1.1* 48.3±3.2*Hypericin 15 5 54.6±5.9* 38.5±1.6* 46.0+±2.1*Hypericin 15 15 65.8±3.7 42.1±0.8* 47.6±3.1*Hype

18、ricin 15 40 69.2±5.2 45.1±2.0* 45.2±2.6*_与病毒对照组比较 *P<0.05,*P<O.01. Compared with Virus group *P<0.05, *P<O.01。 3 讨论 研究发现5，IL-2在急性期心肌炎病变中具有不同的作用。在感染早期病毒血症期(17d)，IL-2具有抗病毒，限制心肌炎症的产生与发展的作用。但在急性非病毒血症期(714d)，IL-2可增加浸润心脏的单核细胞数目而加速疾病的进程和程度上述观点在我们研究的治疗和病毒对照组中得到了充分的印证。实验显示，病毒感染早期时(

19、5 d)，各治疗组的IL-2水平值均高于病毒对照组；而在感染10 d时，金丝桃素治疗组IL-2水平值明显低于病毒对照组，并持续至急性期恢复期(20 d)。说明在感染早期，IL-2可促使T细胞活化，协助NK细胞和单核巨噬细胞清除血液中和感染部位中的病毒，降低心肌炎发生率，有利于机体的保护。而在心肌病毒感染传播迅速期时(10 d)，经IL-2活化的单核细胞大量的聚集在心脏，介导了免疫病理对心肌的损伤，加剧了心肌的炎性反应。调节限制此期的IL-2分泌，对保护心肌、减少炎性反应、局限病变无疑是有益处的。 近年来，干扰素用于病毒性心肌炎的治疗研究备受关注5。用药物作为诱导剂，可启动细胞基因的转录和调节产

20、生干扰素，并随着病毒感染的发生过程能得到越来越充分的表达而发挥机体内在的抗病毒作用。药物诱导的优势在于病毒被清除前，这种表达不会停止而显示出强大的抗病毒作用。我们的研究结果提示，金丝桃素治疗效果的强弱与干扰素的诱生水平密切相关，这种改变与病毒对照组形成明显对比而显示出药物的抗病毒复制、保护心肌的效果。 在病毒性心肌炎中，组织中TNF-a的持续存在，可加剧心肌炎性反应，产生心肌坏死和细胞浸润。此外TNF-a作为一种重要的致炎症介质，其作用与在组织中的水平有关。低水平时组织修复，对机体有利，大量释放时则引起免疫病理损伤6,2。从心肌组织培养上清检测结果可以看出，金丝桃素能阻抑TNF-a的分泌，这在一定程度上提高了机体对病毒的抗性，削弱了病毒对机体的破坏。 综上所述，金丝桃素治疗病毒性心肌炎可能部分通过诱生IFN，调节病毒性心肌炎小鼠感染后不同阶段的IL-2分泌，抑制TNF-a的产生而发挥作用。参 考 文 献1 Liu P,MasonJW.Advanced in the understanding of myocarditisJCirculation,2001,104(9):1076-10812 HU Y F,GONG F Q.The Advancement of Imm