亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与冠心病关系的研究

1、    亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与冠心病关系的研究        【摘要】目的探讨N5-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病的关系。方法利用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法，检测了79名健康人和69名冠心病患者MTHFR基因的677碱基多态性突变CT情况，并加以对照分析。结果冠心病患者MTHFR基因突变型V677基因的频率，明显高于健康人，差异极显著(P0.01)。结论提示MTHFR基因突变型V677基因可能是

2、冠心病的又一个遗传风险因子，为探讨冠心病发病机理提供了新的依据。【关键词】N5-亚甲基四氢叶酸还原酶基因冠状动脉粥样硬化性心脏病聚合酶链反应-限制性片段长度多态性 RELATIONSHIP BETWEEN METHYLENETETRAHYDROFOLATE REDUCTASE GENE POLYMORPHISM AND CORONARY HEART DISEASE【Abstract】ObjectiveThis study inquired into the relationship between methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR)gene p

3、olymorphism and coronary heart disease.MethodsBy polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP),MTHFR 677CT mutation was detected in 79 healthy controls and 69 patients with coronary heart disease.ResultsThe frequency of MTHFR variant V677 of patients was significan

4、tly higher than that of healthy controls(P0.01).ConclusionThis study demonstrated that MTHFR gene V677 mutation was probably one of the genetic risk factors of coronary heart disease and this provided a new basis for exploring the relevant pathogenesis.【Key words】Methylenetetrahydrofolate reductase

5、geneCoronary heart diseasePolymerase chain reaction-Restriction fragment length polymorphism自从1994年Goyette等1人首次将人类的亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reduc-tase,MTHFR)的cDNA分离成功，并将基因定位在染色体1p36.3以来，已发现该基因中有8种突变：6种错义突变、1种无义突变和1种5端剪接位点处的突变。最近利用PCR-SSCP和直接测序等方法，发现一个导致MTHFR不耐热变化的突变：MTHFR基因677碱基C被T置换，使丙氨

6、酸(Ala)变为缬氨酸(Val)，同时产生一个Hinf 和Taq 限制性酶切部位2。我们检测了69名冠心病(coronary heart di-sease,CHD)患者和79名健康人，研究MTHFR基因677碱基的多态频率与冠心病发病机理的相关性，为探索冠心病的发病机理提供资料。1材料与方法1.1研究对象采取哈尔滨医科大学79名健康学生和附属第二医学院确诊冠心病69名患者的肘静脉外周血35ml，ACD抗凝。用常规方法提取基因组DNA。1.2MTHFR基因特定片段的扩增PCR引物：P1(NCO-351)：5-GAAGCAGGGAGCTTTGAGGC-3；P2(NCO-352)：5-CCCATGT

7、CGGTGCATGCCTT-3。PCR反应体系总体积30l：10×Buffer 3l，4×dNTP 1.5l(2.5mol/L)，P1和P2各1l(6pmol/L)，Taq DNA聚合酶(Promega 1U/l)1.5l，模板DNA 5l(40ng/l)。扩增条件：94预变性5分钟，迅速冰浴，加Taq DNA聚合酶，扩增30个循环(94 30秒，62 30秒，72 60秒)，72 延伸5分钟。PCR反应用MJ Research公司的PTC-200 PCR仪进行，PCR产物溴乙锭(EB)染色，2%琼脂糖凝胶电泳检测。1.3Taq 酶切PCR产物酶切体系20l：PCR产物10

8、l，Taq 酶0.2l(10U/l)，10×Buffer 2l，ddH2O7.8l。在DZKW-C型水浴锅中65下进行酶切12小时。1.412%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析制备12%(交联比为291)非变性聚丙烯酰胺凝胶，灌胶后室温凝固2小时以上，200V预电泳30分钟，取10l酶切产物6×Buffer 1l(0.25%溴酚蓝，40%蔗糖)混匀后上样。1×TBE电泳液，200V恒压电泳23小时后揭胶。1.5银染凝胶经过固定(10%乙醇+0.5%乙酸，10分钟)，染色(0.2%AgNO3，10分钟)，显色(1.5%NaOH+0.4%甲醛，至清晰)三步处理。应用Bio-Ra

9、d公司凝胶自动成像系统进行凝胶成像处理、分析和打印，如附所示。附部分冠心病患者MTHFR基因PCR-RFLP产物电泳结果纯合基因型AA：31、32；纯合基因型VV：26、28、36；杂合基因型：27、30、35FigPolyacrylamide gel result of MTHFR 677 nt polymorphism wild type, heterozygous mutation, homozygous mutation (Marker:pBR 322/Msp )Homozygous AA:31，32;Homozygous VV:26，28，36;Heterozygous:27，30，

10、352结果我们应用NCO-351和NCO-352一对引物成功地从基因组DNA中扩增出MTHFR基因的包含有677碱基的长度为134bp片段，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测表明扩增特异性良好。经Taq 限制性内切酶的酶切和12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析后，可产生3种不同长度的片段(附)。其中，只有134bp片段的可视为纯合基因型AA(无Taq 酶切点)，如病例31、32；如被Taq 酶切开可见75bp和59bp两个片段，只有75bp和59bp两个片段的可视为纯合基因型VV，如病例26、28和36；有134bp、75bp和59bp 3个片段的可视为杂合基因型AV，如病例27、30和35。我们的实验

11、结果，79例正常健康人和69例冠心病患者的MTHFR基因为不耐热型，群体基因型频率和等位基因频率(附表)经2检验，均符合Hardy-Weinberg平衡定律。附表正常人与冠心病患者的MTHFR基因频率的比较TabComparison of MTHFR gene frequencies of normal people with those of coronary heart diseaseNumber ofsubjects(例数)Genotype(基因型)Allele frequencies(等位基因频率)AAAVVVAVControls(正常人)79264310(%)32.9154.4312

12、.6660.1339.87CHD(冠心病患者)69103623(%)14.5052.1733.3340.5859.42A：677(CT)；V：677(TC)表中结果分析表明：(1)冠心病患者的变异型等位基因(V)频率为59.42%，高于正常健康人群(39.87%)近20个百分点，经u检验，P0.01，差异极显著。(2)冠心病患者的纯合基因型(VV)频率33.33%，亦高于正常健康人群(12.66%)近18个百分点，经u检验，P0.01，差异极显著。 3讨论不耐热MTHFR基因的这种异变型V677表现为不同程度的酶的活性和耐热性降低3。纯合变异型基因(VV)所致MTHFR酶活性下降明显，此酶活性

13、为正常值的50%。酶加热(46下不耐热)失活后，其酶活性小于30%，而正常者有50%2。不耐热MTHFR基因变异型(V677)较少发生神经学异常。严重型的亚甲基四氢叶酸还原酶缺乏不足正常酶活性的2%，是以神经学的异常、动脉粥样硬化和血管栓塞为特征4。MTHFR缺陷必将导致同型半胱氨酸向甲硫氨酸的转化障碍，最终在血中蓄积形成同型胱氨酸血症。一般认为不耐热MTHFR变异型为常染色体隐性遗传。由于MTHFR基因变异型V677引起的胱氨酸血症与脑血管病，周围血管病和冠心病有一定关系，而胱氨酸堆积导致叶酸代谢紊乱与神经管缺陷的发生有关4。对本实验69例已确诊的冠心病患者和79例健康人进行分析，结果表明冠

14、心病患者纯合突变基因型频率和突变等位基因频率均明显高于正常人群(附表)，证明MTHFR基因变异型V677可能为冠心病的一个遗传风险因素。参考文献1Goyette P, Sumner JS, Milos R, et al. Human methylenetetrahy-drofolate reductase:Isolation of cDNA, mapping and mutation identification. Nature Genet, 1994，7195-200.2Goyette P, Frosst P, Darid SR, et al. Seven novel mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene and genetype/phenotype correlations in severe methylenetetrahydrofolate reductase dificiency. Am J Hum Genet, 1995,561052-1059.3Frosst P, Blom HJ, Milos R, et al. A candicate genetic risk factor for vascular disease: A