荧光定量PCR检测人PDGFB mRNA方法的建立与运用

1、荧光定量PCR检测人PDGFB mRNA方法的建立与运用    【摘要】nbsp;nbsp;目的:克隆人PDGFBnbsp;mRNA的cDNA，并以此作标准品，建立TaqMan技术实时定量检测人PDGFBnbsp;mRNA的方法并加以应用。方法:RT-PCR扩增人PDGFBnbsp;mRNA，将纯化产物与pMD18-T载体连接，转化DH-5感受态细胞。提取重组质粒，以PCR扩增、限制     作者单位：温州医学院 浙江省医学遗传学重点实验室，浙江 温州 325035    【

2、摘要】  目的:克隆人PDGFB mRNA的cDNA，并以此作标准品，建立TaqMan技术实时定量检测人PDGFB mRNA的方法并加以应用。方法:RT-PCR扩增人PDGFB mRNA，将纯化产物与pMD18-T载体连接，转化DH-5感受态细胞。提取重组质粒，以PCR扩增、限制性内切酶双酶切、测序进行鉴定，作为标准品，建立实时定量检测人PDGFB mRNA的方法，用以检测HBSAg阴性组和HBSAg阳性组PDGFB mRNA含量。结果:PCR扩增、双酶切鉴定及测序分析均证实PDGFB cDNA重组成功。实时定量检测PDGFB mRNA后发现，HBSAg阴性组和HBSAg阳性组的Ct

3、值分别为(32.185±2.006)和(21.769±5.256)，浓度分别为(1.27±0.87)×107拷贝/106PBMC和(1.24±0.58)×109拷贝/106PBMC(P<0.05)，后者PDGFB mRNA含量明显高于前者。结论:本研究成功克隆了PDGFB荧光定量PCR标准；荧光定量PCR检测人PDGFB mRNA含量具有快速、准确、简便，特异性强等优点，适用于临床检测。 【关键词】  血小板衍生因子-B 逆转录-聚合酶链反应 T-A克隆 实时定量 乙肝病毒表面抗原    

4、 Establishment and application of the method for determining human PDGFB mRNA with real-time quantitative polymerase chain reaction  ZOU Li-lin, DING Zhi-nan, WANG Zhen, et al. Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325035     Abstract:&

5、#160; Objective:To clone cDNA of human PDGFB and to use it as the standards for real-time quantifying PDGFB mRNA. Methods: Human PDGFB cDNA was amplified with RT-PCR, then ligated with pMD18-T vector and transformed into bacterium DH-5. Plasmid DNA extracted from positive clones was amplified by PCR

6、 and digested with restriction endonucleases and sequenced. The recombinant plasmid DNA was used as the standards for the establishment of the method of real-time quantifying PDGFB mRNA. PDGFB mRNA from person with HBsAg negative and HBsAg positive was detected. Results: PDGFB cDNA cloning was prove

7、d by PCR amplification, digestion and sequence analysis. Determining PDGFB mRNA of person with HBsAg negative and HBsAg positive, Ct value was 32.185±2.006 and 21.769±5.256 respectively, and concentration was (1.27±0.87)×107copies/106PMBC and (1.24±0.58)×109 copies/106P

8、MBC respectively. Conclusion: The method based on TaqMan technology can accurately quantify PDGFB mRNA, and it is suitable for clinical laboratory use.     Key words:  platelet-derived growth factor beta; reverse transcription-polymerase chain reaction; T-A Cloning; real-time qua

9、ntification; hepatitis B surface antigen     血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)可以分为血小板衍生生长因子A（PDGFA）和血小板衍生生长因子B(PDGFB)，它是由多种细胞产生的内源性多肽类生长因子，参与机体的多种病理、生理的调节过程1，如组织修复、胚胎发育及免疫调节等。随着对其研究的深入，PDGF与疾病的关系逐步为人们所重视，PDGF与肝纤维化的发生和发展密切相关，在肝纤维化的病理生理过程中起重要作用2。目前，定量检测PDGFB mRNA的方法，主要是采用逆转

10、录-聚合酶链反应的方法。本研究通过T-A克隆法重组人PDGFB cDNA，以此重组质粒作为标准品，建立实时定量PCR检测PDGFB mRNA的方法，并用来检测HBSAg阴性组和HBsAg阳性组的PDGFB mRNA含量。     1  材料和方法     1.1  标本来源  收集温州医学院第一附属医院HBsAg阴性体检者和HBsAg阳性患者各20例，分别取EDTA抗凝静脉血2 ml。     12  试剂及仪器  RT-PCR体系、pMD18-T载体、D

11、H-5菌种、限制性内切酶EcoRI/HindIII、DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA小量纯化试剂盒（大连宝生物工程有限公司生产）、PCR仪（BIO-RAD/Mycycler）、荧光定量PCR仪（MJ Opticon 2）、紫外凝胶分析系统（GENE GENIUS/BIO IMAGING SYSTEM）、分光光度计（BECKMAN DU80）。     1.3  引物、探针的设计与合成  引物序列：P1：5-GGCCTTCTTAAAGATTGGCTTCT-3；P2：5-GCCTCATAGACCGCACCAAC-3；PCR目的条带长度为179bp。

12、TaqMan探针序列：5-FAM-CTGTCCA GGTGAGAAAG-MGB-3。引物和探针用Primer Premier 5.0软件设计，引物由大连宝生物工程有限公司合成，探针由上海基康生物工程有限公司合成和修饰。     1.4  人外周全血单个核细胞分离及细胞总RNA提取  用淋巴细胞分离液密度梯度离心法，收集单个核细胞，用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取总RNA3。     1.5  RT-PCR  以1.25l总RNA为模板，以Random 9 mers为引物，逆转录反应体系10l。6

13、5 1 min，30 5 min，25 min内匀速升温至65 ，65 20 min，98 5 min，5 5 min。25l PCR反应体系，含0.125l 5U/l Ex Taq，2.5l 10×Ex Taq Buffer，2l 25 mmol/L Mg2+，2l 2.5 mmol/L dNTP，0.5l 25mol/L 引物P1，0.5l 25moul/L引物P2，RT产物1l。95 5 min预变性；94 45 s，60 45 s，72 30 s，共35个循环；最后72 5 min延伸。     1.6  PCR产物纯化、与pMD18-

14、T载体连接及转化  用DNA凝胶回收试剂盒纯化上述PCR产物，取纯化产物1l、pMD 18-T载体1l、T4DNA连接酶1l、10×连接酶缓冲液1l，加无菌双蒸水使总体积为10l。在16 下连接过夜。制备DH-5a感受态细胞，连接产物转化DH 5，在氨苄青霉素平板上根据蓝白斑试验筛选阳性转化菌。     1.7  重组质粒的提取及鉴定  取2 ml的菌液，用质粒DNA小量纯化试剂盒提取重组质粒。PCR扩增：用PDGFB引物对重组质粒进行PCR检测。EcoR/Hind 双酶切反应：10l重组质粒，3l 10×酶切缓冲

15、液，1l EcoR酶液(10 U/l)，1l Hind 酶液(10 U/l)，15l双蒸水，于37 水浴3 h。测序分析：取1 ml阳性转化菌液送至大连宝生物工程有限公司进行测序，结果用blast软件进行同源性分析。     1.8  重组质粒OD值的测定以及标准曲线的建立   取阳性重组质粒测A260，将重组质粒稀释成不同浓度作为标准品进行荧光定量PCR检测。25l PCR反应体系：含0.25l 5 U/l Ex Taq Hs，5l 5×Real Time PCR Buffer，0.5l 250 mM Mg2+，0.75l

16、 10 mmol/L dNTP，1l 25mmol/L引物P1，1l 25mmol/L引物P2，1l 25mmol/L探针，上述RT产物1l。扩增参数为：94 2 min预变性，95 15 s，60 30 s，40个循环。     1.9  荧光定量PCR检测人PDGFB mRNA的临床应用  由20例HBsAg阴性对照和20例HBsAg阳性患者中分离外周血单个核细胞，显微镜下计数，收集106个单个核细胞，提取总RNA，荧光定量PCR检测人PDGFB mRNA的表达。     1.10  统计学处理方法&

17、#160; 采用SPSS13.0统计软件数据包进行分析。HBsAg阴性对照和HBsAg阳性患者的PDGFB mRNA定量检测用两个独立样本t检验分析进行统计分析。     2  结果     2.1  重组质粒PCR扩增鉴定  以提取的重组质粒为模板，用PDGFB引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳可见179 bp的条带（见图1）。     2.2  重组质粒的限制性双酶切反应鉴定  将重组质粒进行EcoR /Hind 双酶切后进行琼脂糖凝胶上电泳，有236

18、 bp条带(包括179 bp的PDGFB cDNA和载体上的57 bp)(见图1)。     2.3  重组质粒测序分析  用通用引物对重组质粒DNA进行测序，序列如下：GGCCTTCTTAAAGATTGGC TTCTTCCGCACAATCTCGATCTTTCTCACCTGGACAGGTCGC AGCTGCACCTGGGTGGGGCGGCACTGCACGTTGCGGTTGTTG CAGCAGCCGGAGCAGCGCTGCACCTCCACACAGGGCG GCCACACCAGGAAGTTGGCGTTGGTGCGGTCTATGAGGC，经blast

19、序列同源性分析，该序列为PDGFB cDNA序列，无碱基突变(参照序列号CU013426)。     2.4  重组质粒浓度计算  测260 nm 吸光度，结果为A260=0.613，A280=0.3346，A260/A280=1.8857。     重组质粒浓度C=A260×50×10-6/(N×340×2)×     6.02×1023(拷贝/ml)=0.18857×50×10-6/(2871×

20、;340×2)×6.02×1023=2.91×1012(拷贝/ml)     N为重组质粒的大小（脱氧核苷酸数量）。将重组质粒原液稀释成1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105拷贝/ml作为荧光定量PCR的标准品。     2.5  标准曲线的建立  1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105拷贝

21、/ml重组质粒作为标准品进行荧光定量PCR分析，荧光强度与循环数的关系见图2，重组质粒浓度的对数与Ct值的关系见图3，线性关系良好。     2.6  荧光定量PCR检测人PDGFB mRNA的临床应用     HBsAg阳性组PDGFB mRNA含量明显高于HBsAg阴性组PDGFB mRNA含量，两者差异具有显著性。     3  讨论     本研究采用T-A克隆法克隆PDGFB cDNA。首先从人单个核细胞中提取总RNA，用RT-PCR扩增PDGF

22、B cDNA。由于DNA聚合酶具有延伸酶活性，能在PCR产物3'端添加一个非模板依赖的核苷酸，这个核苷酸通常是脱氧腺苷酸（A）。pMD18-T 载体是一个3'端突出一个脱氧胸苷酸（T）的线性质粒，可直接与PCR产物连接，环化，转化大肠杆菌DH-5，即可得到PDGFB cDNA重组克隆。T-A克隆法较一般的黏端克隆法更为简捷方便。对目的基因重组克隆进行鉴定，一般采用限制性核酸内切酶消化、目的基因PCR扩增及对目的基因进行测序等方法。这三个方面实验的结果均与目的基因片段完全吻合，由此证明已经成功克隆了PDGFB cDNA。     实时荧光定量PCR技

23、术是目前广泛使用的定量检测靶核酸的常用方法，PCR仪实时采集荧光信号，动态检测扩增产物的聚积，保证在扩增的指数期获得数据来进行定量分析。利用原始模板数的对数与Ct值（达到扩增阈值的循环数）的良好线性关系，可定量检测原始模板数。该方法不但检测准确、敏感、快速，而且闭管分析避免了PCR产物的污染，克服了常规PCR定性检测且易污染的不足。已出现的荧光定量PCR方法有多种，其中应用前景最广泛的方法是TaqMan技术。本研究所用TaqMan-MGB探针为3端标记了自身不发光的淬灭荧光分子，以取代常规可发光的Tamra荧光标记，降低了荧光本底，提高了分辨率；且探针3端结合了小沟结合物(minor groo

24、ve binder，MGB )，使得探针的Tm 值提高，大大增加了探针的杂交稳定性，提高了配对与非配对模板间的Tm值差异，使非特异性杂交显著降低4。     本实验建立的实时荧光定量PCR检测人PDGFB mRNA，具有如下特点：灵敏度较高，结果最低检测限为104拷贝/ml；特异性强，将TNF、HGF等PCR产物作为模板，进行实时定量PCR反应（反应里含PDGFB引物和探针），无扩增信号；线性范围广：在1051010拷贝/ml范围内具有良好的线性，可以比较准确地测定PDGFB mRNA。     将建立的方法应用于临床检测，定量测定H

25、BsAg阴性组和HBsAg阳性患者PDGFB mRNA的含量，发现HBsAg阳性患者的PDGFB mRNA浓度比HBSAg阴性组的要明显地高出几十倍，提示PDGFB mRNA的含量与乙肝有密切的相关性，而乙肝与肝纤维化、肝硬化也有着密切的相关性。有文献报道称，PDGF能够强烈刺激星状细胞(HSC)的增殖和迁移，促使其胶原的产生和沉积，并诱导HSC合成转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子(IGF)等细胞因子，肝星状细胞被激活后转化为成纤维细胞，并合成分泌大量的细胞外基质，这些基质在肝脏大量地沉积，逐步形成肝纤维化5，6。   【参考文献】  1Andrew JG, Hoyland JA, Freemont AJ, et al. Platelet-derived growth factor expression in normally healing human