定量PCR结合STR多态连锁分析诊断缺失型DMD基因携带者

1、中国优生与遗传杂志2002年第10卷第5期 13定量PCR结合STR多态连锁分析诊断缺失型DMD基因携带者吴有光 匡渤海 冯 微 (江西医学院遗传学研究室,南昌,330006)摘 要: 目的 直接定量PCR结合STR单体型连锁分析,以便更准确检出缺失型家系中DMD基因携带者。方法 在内标引物参照下,PCR扩增22个循环,产物在琼脂糖凝胶分离,EB显色,照相后,扫描定量,同时应用5个STR多态位点的单体型连琐分析,检测缺失型的DMD基因女性携带者。结果 直接定量PCR分析了6个家系中的8个外显子48缺失的DMD母亲或女性同胞,检出7个DMD为携带者;STR多态单体型连锁同样分析这6个家系中的8个

2、女性亲属,亦检出7个DMD基因携带者,二种方法所得结果完全一致。结论 STR多态连锁分析与直接定量PCR法结合,可更准确,全面检出DMD基因携带者。关键词: 直接定量PCR;STR多态连锁分析;DMD;携带者检出DetectionofDMDcarriersindeletionfamiliesbyquantitativepolymerasechainreactionandthelinkageanalysisofshorttandemre peatpolymorphisms.WuYouguang,KuangBohai,FengWei.(ResearchLaboratoryofMedicalGene

3、tics,JiangxiMedicalCollege,Nan chang,330006)Abstract:Objective:TodetectDMDgenecarriersinthedeletionfamiliesaccurately,usingquantitativePCRtechniqueandthelinkageanalysisofSTRpolymorphisms.Methods:DNAsamplesareabstractedfromfemalesinexon48deletionDMDfamilies.PCRareperformedfor22cycles,contrastedwithin

4、ternalstandardprimerlocatedinthisgene.Afterseparatedon1 5%agarosgelelectrophoresisandstainedwithEBtheseparatedbandingsofPCRproductsaretakenphotographyandperformedquantitativeanalysisonTLCdensitometer.Atthesametime,themonosomylinkageanalysisareperformedwith5lociofSTRpolymorphisms.Results:8casesofposs

5、iblecarriersin6DMDfamilieswithexon48locusdeletionaredetectedbyquantitativePCRand7carrieswithdeletionDMDgenearediagnosed.And7casesofDMDgeneCar riersin6samedeletionDMDfamiliesaredetedtedusingthelinkageanalysisofSTRpolymorphisms.Theresultsareidenticalbetweentwoanalysismethodsabove.Conclusion:Usingtwome

6、thodsofthelinkageanalysisofSTRpolymorphismsandquantitativePCRtechnique,canbedetectedthecarriersinDMDdeletionfamiliesmoreaccuratelyandmoreeffectively.Keywords:QuantitativePCR;STRpolymorphiclinkageanalysis;DMD;Carrierdetective DMD(Duchenne进行性肌营养不良症)是具有严重危害性,而又无有效治疗方法的一种X染色体隐性遗传病。进行产前基因诊断,防止有病胎儿出生,是目前防

7、治的基本对策。但对高危孕妇进行产前诊断,必须首先了解先证者患儿的基因变异类型及突变的可能位点,同时也必须了解DMD的女性亲属是否为DMD基因携带者。因而对DMD基因女性携带者的基因检出是产前基因诊断的必要条件。在用mPCR(多重引物聚合酶链式反应)筛测DMD患儿的基因变异类型是缺失型(约占60%)抑或非缺失型(约占40%)。针对不同突变型,其家系中携带者检出可有不同方法:对于非缺失型家系及部分缺失型家系,可以采用STR(短串联重复序列)多态位点的单体型连锁分析1,2;对于缺失型家系还可采用直接定量PCR分析3,4。两者结合起来,可以获得更多诊断信息,可更准确检出DMD基因携带者。DMD基因缺失

8、型的女性携带者,只有一个X染色体上发生缺失,故理论上该缺失位点的模板数,半合子的携带者与正常女性之比为1 2。在PCR反应中要测定相对模板数或相对模板起始浓度,必须在反应的指数增长区。PCR反应的指数增长过程大约至2022次循环,约在25个循环后产达5用PCR时,采用20周循环,而Panos等用 P标记的dCTP掺入PCR法所用循环周数为22。本文采用EB显色,亦可只循环22周,方便而实用。但EB显色的灵敏度有限,又要确保反应在指数增长区,故需结合STR多态单体型连锁分析,以得更准确诊断。资料与方法1.缺失型家系:经mPCR筛测,取ex48(外显子48)位点缺失的DMD家系。2.DNA样品:用

9、盐析法提取血细胞基因组DNA7。3.寡核苷酸引物:外显子48引物及作内标的外显子12引物序列,参考文献8,5个STR多态位点引物的碱基序列参考文献1,由上海生工生物工程技术服务公司合成。4.直接定量PCR:(1)PCR扩增 ex48引物扩增片段作测定目的片段,ex12引物扩增片段作内标对照。其扩增条件及参数为:50100ng基因组DNA,ex48引物16pmol,而ex12引物12pmol,反应终体积30 l,94 灭活5min后加入1 5UTaqDNA聚合酶,再依次按94 30s,54 130s,72 130s,循环22周,最后在63214(2)凝胶电泳 取扩增产物15 l上样,1 5%琼脂

10、糖凝胶电泳后,在透射紫外光分析仪下摄影。(3)扫描定量分析 将冲洗好的底片或相片,在cs-930型薄层扫描仪上定量扫描。锯齿波方式设背景校正,吸收波长 =540nm。所得ex48产物带与内标ex12产物带的吸收面积之比,再除以正常女性此二条带吸收面积之比的平均值,若A48/A12 0 5,即为基因携带者。(4)扩增周期数的选择:取ex48引物,按(1)中反应条件中及参数,分别扩增16、18、20、22、24、27、31及35周的不同周数。将其各产物的凝胶分离带进行扫描定量,选择保证在指数增长期,而EB又可显出产物电泳带的扩增周期数为定量分析的循环周数。5.STR多态位点单体型连锁分析:采用dy

11、strophin基因中央热点区的四个内含子中位点引物(STR44、STR45、STR49、STR50)和5 端非编码区肌肉启动子的一个5 DYS- 位点,NOA48A12A48/A12123176252250 92210092114830 88316102181620 89中国优生与遗传杂志2002年第10卷第5期其分析方法同文献9。结 果1.直接定量PCR循环周数的选择取16、18、20、22、24、27、31、35不同循环周数的PCR产物的琼脂糖电泳带,经扫描定量,获得相应光吸收相对面积。在我们实验条件下,循环27周已达棚区,24周似尚在指数增长后期。为确保分析用的周数在指数增长区,我们选

12、用第22周。2.正常女性DNA样品的A48(ex48产物吸收值)与A12(内标ex12产物吸收值)之比值。6名正常女性DNA的二个片段扩增产物的相对扫描吸收值之比见表1,其A48/A12在0 88至0 98之间,平均值为0 915 0 03。表1 正常女性DNAex48与内标ex12扩增产物扫描相对吸收值(n=6)413178134860 9859937106370 93622039246430 890 915平均3.受检者DNA样品的A48与A12之比值各受检的可能携带者的基因组DNA的ex48与ex12的扩增片段产物的相对扫描吸收比值见表2。除NO2的A18/NOA48A12比值校正比值D

13、MD携带3600 392419547940 8750 963407296830 4200 464A12=0 96外,其余均小于0 5,故可诊断为ex48半合子(即DMD携带者),而NO2应为非携带者。图1为它们的电泳分离带及其扫描吸收峰。5253687630 2890 326215679200 2720 307221068120 3240 358364792120 3960 43表2 受检者DNA样品ex48与内标ex12扩增产物扫描相对吸收比238252740 4520 49注:校正比值=比值 0915图1 可能携带者DNA的ex48及内标ex12扩增产物凝胶电泳分

14、离带及其扫描吸收峰4.STR多态位点单体型连锁分析高(0 720 91),可以较准确检出DMD携带者1,9。但若基对此6个缺失型家系中的可能DMD携带者同时进行了5个STR多态位点的连锁分析,其中No.1与No.2,No.5与No.6分别为母女,其他均只对先证者母亲作了分析,其中分析了母女的两个家系的单体型分析图见图2。在6个家系中,DMD的母亲均为携带者,其诊断结果与直接定量PCR分析完全相符。讨 论5个STR,量因缺失外显子45至外显子49/50片段时,携带者的一条染色体上亦可能缺失STR45和STR49信息量最高的两个位点,且PCR扩增过程中可能产生滑动合成1,这可能给结果分析带来一定困

15、难。若结合直接定量PCR分析,可对缺失型家系中携带者检出得到更准确结果。本文中二种方法的分析结果完全符合。虽然已有定量PCR仪可售,但仪器昂贵。每个位点都需要特异的荧光标记探针和专用软件等,难于适用于缺失位点多种的DMD基因携带者检出。同位素标记或有,10中国优生与遗传杂志2002年第10卷第5期Panos3等报导采用密度计扫描直接定量PCR来简化繁琐的处理。本室在建立了较成熟的STR多态单体型连锁分析15DMD基因携带者的基础上2,9结合直接定量PCR分析,取得较好效果。图2 DMD基因携带者STR多态单体型连锁分析注:家系1中先证者缺失外显子45、48,del表示缺失利用直接定量PCR分析

16、法来检测缺失型DMD携带者,是因为DMD基因女性携带者有一条X染色体上亦缺失同样位点片段,理论上,其PCR扩增产物为正常女性DNA的1/2,但要准确测得模板相对起始浓度,必须在PCR过程的指数增长区进行,PCR反应过程可能在25个循环周就达到棚区5,故直接定量PCR循环周数应少于25周。为了采用EB染色,而又保证PCR只扩增不到25周,我们调整PCR各参数,实验选择出循环22周,结果比较满意。定量扫描可以直接在底片上进行,亦可将底片冲洗成照片,用反射吸收,设置背景校正,行锯齿式扫描。在内标对照上,似可以直接从照片,用肉眼初步差别出半合子带及正常带。参考文献musculardystrophyca

17、rriersbyquantitativemultiplexpolymerasechainre actionanalysis.Neurology,1992,42:17834李洵桦,刘焯霖,梁秀龄.直接定量PCR对缺失型DMD基因携带者的诊断.中华医学遗传学杂志,1997,14:495MorrisonC,GannonF.TheimpactofthePCRplateanphaseonquantita tivePCR,BiochemetBiophysActa,1994,1219:4936SchwartgLS,TarletonJ,PopovichB,etal.Fluorescentmultiplexli

18、nkageanalysisandcarrierdetectionforDuchenne/Beckermusculardystrophy.AmJHumGenet,1992,51:7217吴有光,匡渤海,周洪.血细胞基因组DNA的无机盐析法提取.江西医学院学报,1998,38:528ChamberlainJS,GibbsRA,RanierJE,etal.MultiplexPCRforthedi agnosisofDuchennemusculardystrophy.InPCRprotocolsAguidetomethodsandapplications InnisMA,GelfandDH,Snins

19、kyJJ,eds.Aca demicpressNewYorkLandon,1990,272-2819匡渤海,吴有光,汪安安,等.Dystrophin基因内部四个STR位点多态性与DMD基因携带者检出.江西医学院学报,1999,39:1510StephenA,MartinB.AnalysisofquantitativePCRforthediagnosisofdelectionandduplicationcarriersinthedystrophingene.JMedGenet,1992,29:191收稿日期:2001-12-311ClemensPR,FenwickPG,ChamberlainJS,etal.CarrierdetectionandprenataldiagnosisinDuchenneandBcckermu