全血线粒体DNA萃取试剂盒产品说明书中文版

1、全血线粒体DNA萃取试剂盒产品说明书(中文版)主要用途全血线粒体DNA萃取试剂是一种旨在通过化学溶解纯化血白细胞、物理或化学破膜及离心处理获得线粒体，然后进一步生物酶处理以获得高质量的线粒体DNA的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物血细胞中的线粒体核酸成分处理。用于后续的杂交、克隆、酶切、PCR分析等。产品即到即用，操作简易，性能稳定，无核酶污染，萃取纯度和产量皆高。技术背景线粒体细胞器的研究是现代细胞生物学的最重要的课题之一。线粒体成为生物衰老、古生物、细胞凋亡、肿瘤、HIV、老年痴呆症、糖尿病、肌肉疾病等研究的主要对象。线粒体DNA的分离和定量以及突

2、变分析是研究中必不可少的。产品内容溶血液(Reagent A)毫升清理液(Reagent B)毫升裂解液(Reagent C)毫升净化液(Reagent D)毫升强化液(Reagent E)毫升保存液(Reagent F)毫升破膜液(Reagent G)毫升去干扰液(Reagent H)微升酶解液(Reagent I)微升萃取液(Reagent J)毫升浓缩液(Reagent K)毫升助沉液(Reagent L)微升沉淀液(Reagent M)毫升纯化液(Reagent N)毫升缓冲液(Reagent O)毫升产品说明书1份保存方式保存净化液(Reagent D)、 去干扰液(Reagent

3、H)、 酶解液(Reagent I)、萃取液(Reagent J和 助沉液(Reagent L)在20°C冰箱里，其余的保存在4 °C冰箱里，有效保证 6月用户自备1.5毫升离心管：用于核酸操作的容器15毫升锥形离心管：用于线粒体初步制备的容器50毫升锥形离心管：用于血细胞处理的容器涡旋震荡仪：用于混匀4C微型台式离心机：用于沉淀细胞和核酸4'C超速离心机：用于分离细胞器成分DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞58 C恒温水槽：用于孵育反应物实验步骤一、白细胞分离实验开始前，室温预热血溶液(Reagent A),同时4C预冷 清理液(Reagent B)。然后进行下列操

4、作。1. 准备2个无菌的50毫升锥形离心管2. 轻轻混匀新鲜的EDTA抗凝的全血样品3. 分别移出5毫升全血样品到每个 50毫升锥形离心管4. 分别加入毫升室温预热的 血溶液(Reagent A)5. 轻轻上下倾倒离心管 5次，确保充分混匀6. 室温下(25C)孵育4分钟，期间轻轻上下倾倒离心管数次(注意：肉眼可以观察到血液颜色由不透 明红色到清澈红色的变化)7. 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g& 小心抽掉上清液，留下 500微升液体，以防抽掉白细胞颗粒群9. 用手指轻弹离心管2至3下，使白细胞颗粒群松动10. 分别加入毫升预冷的 清理液(Reagent B)，混匀细胞11.

5、 2管50毫升锥形离心管合并为 1管12放进台式离心机离心10分钟，速度为300g13. 小心抽去上清液14. 加入毫升预冷的 清理液(Reagent B)，混匀细胞15放进台式离心机离心10分钟，速度为300g16.小心抽去上清液，确保没有液体残留(注意：如果暂时停止操作，须暂时放进一70C冰箱里)二、白细胞线粒体分离实验开始前，将试剂盒里的 净化液(Reagent D)冻融，然后移出毫升 净化液(Reagent D)和 毫升的 裂解液(Reagent C)到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作，根据用户要求选择其中一种方法：方法一：细胞匀浆法1.

6、 加入预冷的毫升裂解工作液2. 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群3. 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器4. 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞(约 20至40下)(注意：参见注意事项11)5. 将所有细胞匀浆物移入 15毫升锥形离心管6. 放进4'C台式离心机离心10分钟，速度为1500g7. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管一一此步骤去除细胞核和未溶解的细胞8 放进4C超速离心机离心10分钟，速度为10000g9. 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒 一一此步骤获得线粒体沉淀物方法二、化学处理法1. 加入预冷的毫升裂解工作液2. 涡旋震荡5秒，充分混匀3. 在冰槽里孵育2分钟，其中

7、每间隔一分钟涡旋震荡5秒4. 加入预冷的微升 强化液(Reagent E)5. 涡旋震荡5秒，充分混匀6. 在冰槽里孵育5分钟，其中每间隔一分钟涡旋震荡5秒(注意：参见注意事项12)7. 加入预冷的毫升 保存液(Reagent F)，用手指轻弹混匀8 放进4C台式离心机离心10分钟，速度为1500g9. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管一一此步骤去除细胞核和未溶解的细胞10. 放进4C超速离心机离心10分钟，速度为10000g11小心抽去上清液，保留沉淀颗粒一一此步骤获得线粒体沉淀物三、DNA萃取1. 加入 微升破膜液(Reagent G)到线粒体颗粒样品中2. 涡旋震荡15

8、秒，混匀颗粒群3. 转入1.5毫升离心管4. 置入冰槽中孵育15分钟5. 加入 微升 去干扰液(Reagent H)6. 用200微升枪头上下抽吸混匀7. 放进37C恒温水槽孵育15分钟8 加入 微升酶解液(Reagent I)9.涡旋震荡15秒10放进58C恒温水槽或干式恒温仪孵育2小时(注意：可以孵育4至16小时，增加萃取产量)11置于室温下冷却15分钟，直至处于室温状态(或置于冰槽里15至30秒)12. 加入 微升 萃取液(Reagent J)(注意：使用前摇匀)13 涡旋震荡15秒14.放进微型台式离心机离心 10分钟，速度为16000g (或13000RPM，例如eppendorf

9、5415)15移出上层液相溶液到新的1.5毫升离心管(注意：切莫触碰液相交界面上的白色膜状物)16. 加入微升 浓缩液(Reagent K)17. 加入微升助沉液(Reagent L)18. 加入微升 沉淀液(Reagent M)19在涡旋震荡仪上震荡 15秒，充分混匀20.放进微型台式微型离心机离心15分钟，速度为16000g (或13000RPM，例如eppendorf 5415)(注意：离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒)21 小心抽掉上清液22. 加入毫升纯化液(Reagent N)23. 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g (或13000RPM，例如eppe

10、ndorf 5415)24. 小心抽掉上清液25. 空气中晾干沉淀颗粒群26. 加入微升缓冲液(Reagent O)27溶解后放进20C冰箱长期保存或移出 2微升进行PCR反应注意事项1. 本产品为20次操作2. 操作时，避免污染母液，尤其是 裂解液(Reagent C)和 保存液(Reagent F)3. 线粒体操作均须在4 °C或以下状态下进行4. 操作时，须戴手套5. 建议使用新鲜全血6. 全血样品采集建议使用EDTA血液抗凝液(HL12054.1 )、ACD血液抗凝液(HL12054.2 )或肝素钠血液抗凝液(HL12054.3 )7. 试剂中的溶液使用前摇匀；酶解液(Rea

11、gent I)需放进37C温育少许；为避免反复冻融，建议适量 分装8 建议全血样品和 血溶液(Reagent A)充分混匀，否则造成血红细胞的不完全溶解9. 建议全血样品和 血溶液(Reagent A)孵育时间避免过长，不宜超过5分钟，以防白细胞损害10. 每毫升全血平均可获得 2.5 X 106白细胞11通常匀化次数为 20至40下(或细胞颗粒群消失为止)达到80%的细胞裂解为理想状态，但不同的细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50%可以增加匀化次数12通常孵育5分钟(不宜超过5分钟)达到80%的细胞裂解为理想状态，但不同的细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察 3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50%可以增加孵育时间和涡旋震荡次数13. 可以通过增加线粒体溶解时间(30分钟)和酶解时间(直至 16小