醛糖还原酶基因多态性与2型糖尿病及视网膜病变的相关性

1、醛糖还原酶基因多态性与2型糖尿病及视网膜病变的相关性    【摘要】  目的 探讨2型糖尿病醛糖还原酶（AR）基因5端(AC)n多态性与2型糖尿病（DM）并发背景型视网膜病变（BDR）的关系。方法 随机选取DM患者74例，其中并发BDR39例，无视网膜病变35例，正常对照组40例。经多聚酶链反应（PCR）?琼脂糖凝胶电泳，检测AR基因5端（AC)n多态性标记。结果 在2型糖尿病患者和正常对照组中共检测出7种等位基因，其中以Z、Z2、Z-2三种等位基因最常见。 Z-2等位基因在BDR组高于NDR组和CON组；Z+2等位基因在BDR组低于NDR组和

2、CON组。结论 山东地区2型DM患者AR基因5端 (AC)n存在7种等位基因，Z-2等位基因可能是BDR的易感基因，Z+2等位基因可能为其保护基因。 【关键词】  糖尿病，2型；醛糖还原酶；基因；视网膜病变Abstract： Objective  To study the relationship between polymorphism of (AC)n in the 5end of the AR gene and background diabetic retinopathy(BDR). Methods  74 patients with diabetes m

3、ellitus (DM), 39 with BDR and 35 without, and 40 controls were enrolled in this study. PCR?agarose gel electrophoresise was used to determine the polymorphism marker of (AC)n dinucleotide in the 5end of the AR gene. Results  7 alleles, mostly Z, Z2, and Z-2 alleles were observed in type 2 diabe

4、tes mellitus and controls. Frequency of allele Z-2 was significantly higher in the BDR group than in the non?diabetic retinopathy(NDR) group and the control group, however, frequency of allele Z+2 was  significantly lower in the BDR group than in the NDR group and the control group. Conclusions

5、  7 alleles were found in the 5end of the AR gene in type 2 DM patients in the Shandong area, of them, the  Z-2 allele might be the susceptible gene and the Z2 allele might be the protective gene. Key words： Diabetes Mellitus, type 2; Aldose Reductase; Genes; Retinopathy   &

6、#160; 糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）是糖尿病微血管病变在眼底独特环境中的表现，已成为发达国家成年人致盲的最重要的原因，大约21%的2型糖尿病患者在诊断之时即存在视网膜病变，并且大部分患者在整个病变过程中会出现程度不等的视网膜病变1。近十年的研究已经证实，长期慢性高血糖是导致糖尿病微血管并发症的主要原因，且通过三种途径起作用：醛糖还原酶（aldose reductase， AR）的激活，蛋白激酶C的活化和非酶糖基化蛋白的堆积。在糖尿病高糖状况下，多元醇通路过醛糖还原酶基因多态性与2型糖尿病及视网膜病变的相关性度激活对糖尿病慢性并发症的发生起重要作用。AR

7、是多元醇代谢途径的限速酶，该酶基因表达异常或酶活性改变，势必影响糖尿病微血管并发症的发生。Ko等2对居住香港的中国人T2DM患者进行分析，发现AR基因5端有一个微卫星多态性，并且此多态性与增殖型糖尿病视网膜病变有关。此后的一些非中国籍人群的研究3?5，也同样发现基因微卫星多态性与2型糖尿病视网膜病变有一定的关联。本研究旨在探讨山东地区2型糖尿病患者非增殖型视网膜病变与AR基因5端的(AC)n的多态性的相关性。1  资料与方法1.1  研究对象 糖尿病组：按照1997年美国糖尿病协会（American Diabetes Association, ADA）的糖尿病诊断和分型标准

8、，随机选择千佛山医院2006年7月2007年6月住院及门诊2型糖尿病患者74例，其中男42例，女32例，平均年龄（59.2±12.1）岁。经临床检查排除糖尿病急性并发症、感染、手术等应激情况，无其他慢性肾脏疾病、高血压、冠心病和恶性肿瘤。所有患者均由2名特定的眼科医生经扩瞳直接眼底镜检查眼底，部分患者行眼底荧光造影，依照1985年全国第三届眼科学会议标准排除增殖型糖尿病视网膜病变者，分为： 背景型视网膜病变（background diabetic retinopathy, BDR）者39例，男23例，女16例，平均年龄（59.6±11.3）岁，平均病程（3.4±1

9、.3）年； 糖尿病无视网膜病变（non?diabetic retinopathy, NDR）者35例,其中男19例，女16例，平均年龄（58.7±13.1）岁，平均病程（14.4±3.1）年。正常对照(CON)组:40例，男22例，女18例，平均年龄（56.8±13.5）岁，均为无糖尿病、糖耐量异常、高血压、冠心病、肥胖及其它眼底病变，3代内无糖尿病家族史的同期健康体检者。1.2  方法1.2.1  一般临床资料 所有研究对象均测量身高、体重，并计算体重指数（Body Mass Index，BMI）。全自动生化仪测血脂、血糖。高压液相法测糖化血

10、红蛋白。1.2.2  DNA提取 取2%EDTA抗凝的外周静脉血1?mL，应用北京天根公司TIANamp Blood 血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。1.2.3  PCR扩增目的基因片段 5端及3端引物分别为AR?Pr1：5?GAA TCT TAA CAT GCT CTG AAC C?3,AR?Pr2:5?GCC CAG CCC TAT ACC TAG T?3，由上海博亚生物有限公司合成。扩增条件为94?始变性5?min，94?变性30?s，55?退火45?s，72?延伸90?s，共循环30个周期，72?终末延伸10?min。反应总体积为50?L：5?L10&#

11、215;PCR缓冲液，0.25?g模板DNA，两个引物各1?mmol/L，4种dNTPs各0.15?mmol/L，TapDNA聚合酶1?U，加无菌蒸馏水至50?L反应体积。1.2.4  PCR反应产物电泳 反应产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，根据迁移距离确定样品所属等位基因。本研究把扩增出的138?bp长的DNA片断命名为Z等位基因，那么Z+2等位基因将比Z等位基因长(A?C)2个bp，Z-2等位基因将比Z等位基因短(A?C)2个bp，并依次类推6。1.3  统计学处理 临床计量资料采用±s表示，组间比较用t验。AR等位基因数目用直接计数法，并计算等位基因频率分布用2

12、检验，检验水平为P0.05差异有统计学意义。2  结  果 2.1  病例及对照组一般临床及实验室资料 见表1（略）。3组间性别构成、年龄、体重指数、糖尿病家族史均无差异，具有可比性，为了清除病程对微血管并发症的影响，本研究入选的NDR患者病程均10年，平均（14.4±3.1）年,与BDR相比差异有统计学意义（P0.001）。NDR组、BDR组与CON组相比，空腹血糖（FBS）、糖化血红蛋白（HbA1c）均明显升高。2.2  PCR反应产物电泳结果 CON组和糖尿病组均发现7种等位基因：Z-6、Z-4、Z-2、Z、Z+2、Z+4、Z+6。各等位

13、基因间长度差异为2?bp，亦即由Z-6等位基因至Z+6等位基因长度为132?bp144?bp。选择泳动在138?bp的纯合子（Z/Z）等位基因的PCR产物进行DNA测序，结果证实AC重复次数为24（见图1、图2）。因此推算，Z-6、Z-4、Z-2、Z+2、Z+4?和Z+6等位基因（AC）n中n分别为21、22、23、25、26、27。2.3  7种等位基因在各组中的分布频率 与NDR组相比，BDR组的Z-2等位基因频率显著增加，而Z+2?等位基因频率在BDR组显著低于NDR组，见表2（略）。3  讨  论    AR属于NADPH依赖

14、型醛-酮还原酶家族，存在于多种组织中，是多元醇通路的限速酶，其活性升高在DR的发生、发展中起重要作用。正常血糖浓度时，该酶活性不高，葡萄糖进入细胞后很快被已糖激酶转变为6?磷酸葡萄糖，而后进入三羧酸循环，为细胞代谢提供能量，也可经酵解或戊糖旁路代谢。但糖尿病时，血糖浓度升高超过了以上通路的代谢能力，致使大量葡萄糖经多元醇通路，即AR将醛糖转化为山梨醇和果糖，山梨醇和果糖不易通过细胞膜向外扩散，聚集在细胞内，引起组织结构和功能异常，影响血管通透性，使毛细血管基底膜增厚，最终导致视网膜微动脉和毛细血管结构上的改变：周细胞变性、基底膜增厚和内皮细胞增生。这些改变为非增殖型糖尿病视网膜病的特征性表现7

15、。本研究结果显示，BDR组、NDR组FBS水平（9.51±2.71）、（8.86±2.97）较CON组（5.23±0.54）明显升高，差异具有统计学意义（P0.001），两组HbA1c水平（8.00±1.41）、（7.65±2.04）较CON组（4.32±0.42）亦明显升高，差异具有统计学意义（P0.001）（见表1），从而说明血糖长期控制不良是引起糖尿病并发症的一个重要原因；同时高血糖状态下，AR活性增高，引起多元醇通路的激活,后者通过启动高渗应激、葡萄糖及脂质氧化应激、蛋白质的非酶糖基化单独或协同作用造成视网膜病变的发生、发展8

16、。    本文资料选择病程5年内就出现糖尿病视网膜病变的患者，旨在利用该部分患者具有较强的遗传易感性，以便找出易感候选基因。AR是由位于第7号染色体长臂（7q35）的醛糖还原酶基因编码，该基因由10个外显子和9个内含子组成，全长约18?kb。国外大量研究报道其5端启动子上游2.1?kb区存在AR基因多态性即(AC)n二核苷酸串联重复序列与糖尿病的微血管并发症密切相关。本研究选择山东地区人群作为研究对象，其中2型糖尿病患者74例，无糖尿病对照组40例。同样发现存在该微卫星多态，其中Z-2(AC)23等位基因在BDR组（28.2%）高于NDR组（8.6%）和CON组（

17、10.0%），差异有统计学意义（24.635和24.255，P0.05）；Z+2 (AC)25等位基因频率在BDR组（15.4%）低于NDR组（37.1%）和CON组（35.0%），差异有统计学意义（24.576和24.018，P0.05）。其余5种等位基因频率BDR组与NDR组和CON组差异无统计学意义（P0.05）。说明Z-2、Z+2等位基因可能与BDR的发生有关。携Z-2等位基因患者易产生BDR，提示该等位基因是山东地区人群DR发病的危险因子；Z+2等位基因者的相对危险度仅为0.31，提示该等位基因可能为山东地区人群BDR的保护性基因。    由此可见,高血

18、糖、AR活性升高和多元醇积聚在糖尿病慢性微血管并发症的发生中起着非常重要的作用，如何阻止或延缓并发症的发生发展是糖尿病治疗的重点。目前,除了对糖尿病患者进行良好的血糖控制外,醛糖还原酶抑制剂的应用研究是今后防治工作的重点之一。近年来，对于AR基因在某些糖尿病慢性并发症的发生和发展中的重要性已得到公认，目前对AR基因的研究主要集中在5调控区，但AR基因的3端及此基因中长度相当于外显子十几倍的内含子也可能含有某些与AR活性增高相关的调控元件，对这些区域的研究是目前有待深入。【参考文献】  1Fong D S, Aiello L, Gardner T W, et al. Retinopat

19、hy in diabetesJ. Diabetes Care, 2004, 27(1):84?87. 2Ko B C,Lam K S, Wat N M, et al. An(Ac)n dinucleotide repeat polymorphic marker at the 5 end of the aldose reductase gene is associated with early?onset retinopathy in NIDDMJ. Diabetes, 1995, 44(7):727?732.3Sivenius K, Niskanen L, Voutilainen?Kaunis

20、to R, et al. Aldose reductase gene polymorphism and susceptibility to microvascular complications in type 2 diabetesJ. Diabet Med, 2004, 21(12):1325?1333.4Zghal?Mokni I, Arfa I, Elloumi?Zghal H, et al. Association study between diabetic retinopathy and aldose reductase gene polymorphism in TunisiansJ. J Fr Ophtalmol,