足叶乙甙诱导HL-60细胞凋亡过程中电化学行为的研究

1、    足叶乙甙诱导HL-60细胞凋亡过程中电化学行为的研究        【摘要】目的研究药物诱导白血病细胞凋亡中的电化学变化及其意义。方法使用电化学传感器检测经足叶乙甙（Vp16）诱导的HL-60细胞凋亡。结果2200g/ml Vp16作用于HL-60细胞24小时的过程中，随着药物剂量的增大，细胞峰值电流逐渐降低，Vp16 2g/ml时即可观察到细胞电化学活性较对照组下降，20g/ml时明显下降。以Vp16 200g/ml诱导细胞凋亡，通过DNA含量分析显示在2，3，4小

2、时细胞凋亡率为10.5%20.0%，用电化学传感器方法检测细胞电化学活性改变差异明显，峰值电流从1.8A降至0.4A，4小时时峰值电流降至用药前的1/5。结论在细胞凋亡早期启动阶段的电化学信号改变具有一定的早期意义和蓄积性。【关键词】电化学生物传感器细胞系，HL-60依托泊甙 细胞死亡，程序性 Study on electrochemical behavior of HL-60 cells during the etoposide-inducing apoptosisREN Xinping?, WANG Debing, LI Huaina, et al.Institute of Hematol

3、ogy, Beijing Medical University，Beijing100044【Abstract】ObjectiveTo study the electrochemical behavior of apoptotic HL-60 cells induced with etoposide. MethodsElectrochemical cytosensor was used to monitor HL-60 cells treated with etoposide. ResultsThe peak current and electron transfer rate decrease

4、d as etoposide dosage increased. The decrease appeared at 2g/ml etoposide treatment and was remarkable at 20g/ml, which occurred before the typical changes of cell morphology and DNA contents for apoptosis. FCM-DNA analysis showed that the apoptotic cells were of 10.5%20% while the peak current decr

5、eased from 1.8A to 0.4A after 2,3 and 4 hours treatment with 200g/ml etoposide, and the peak current after 4 hours treatment was 5 times lower than that before induction. Conclusion The changes of electrochemical behavior during the early stage of apoptosis occurred earlier and could be accumulated.

6、【Key Words】ElectrochemistryBiosensorsCell line, HL-60EtoposideApoptosis细胞凋亡是多细胞动物生命活动中不可缺少的组成部分，被广泛应用于胚胎发生和发育、器官平衡稳定、免疫防御和对肿瘤发病机制的研究之中。与细胞坏死不同的是，细胞凋亡是受到某些生理或病理信号刺激后受严格控制的事件，具有典型的形态学和生化学特征，即形态学观察到凋亡小体的出现，DNA电泳有200bp左右的梯形条带，DNA含量分析显示亚二倍体凋亡峰1，2。在这些表现出现之前，细胞已经经历过一系列生化和生理变化，其机制尚不完全清楚，因此对这些变化的研究成为研究细胞凋亡的重

7、要内容3。我们采用电化学的方法观察HL-60细胞在化疗药物足叶乙甙（Vp16，北京制药厂生产）诱导的细胞凋亡过程中的电化学行为，表明在细胞凋亡早期，细胞具有活跃的电化学活性改变。深入研究这种变化有助于对细胞凋亡早期机制的认识。材料和方法1细胞及细胞培养取对数生长期HL-60细胞，在体积分数为5%的CO2、37条件下，用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，细胞浓度为5×105/ml。加药组：分别以2，4，10，20，40，80，100，150，200，300g/ml Vp16作用24小时，以40，200，500g/ml Vp16作用14小时，对照组不加药物。2活细

8、胞计数取上述细胞悬液， 加入等体积的台盼蓝染液，混匀后计数，拒染细胞为活细胞（包括凋亡细胞），染为蓝色的细胞为坏死细胞。3细胞形态学检测取细胞经磷酸盐缓冲液(PBS）洗2遍后，细胞悬液经离心涂片机涂片，瑞氏染色后光镜观察。4DNA含量分析及DNA电泳1×106细胞以体积分数为70%的乙醇固定过夜，离心弃上清，加入50l柠檬酸-PBS，室温30分钟，离心，取上清（含有小分子量DNA）进行DNA电泳，继续加入3l 体积分数为0.25%的NP40，3l RNaseA，37水浴30分钟，3l蛋白酶K（1mg/ml）37水浴30分钟，无水乙醇及3mol/L乙酸铵沉淀2小时，离心后加上样缓冲液，

9、50V电泳2小时，紫外灯下观察。沉淀细胞复悬于0.5ml PBS中，进行细胞DNA含量分析，加入终浓度50g/ml RNaseA 30分钟后，加入终浓度50g/ml碘化丙锭（PI）避光染色30分钟后上机检测，与对照组相比，低于G0/G1期细胞为凋亡细胞，其占细胞总数的比例为凋亡细胞比例。5细胞电化学反应检测使用北京大学化学研究所负压型电子伏安细胞传感器完成。该电极感受系统由三个电极组成，细胞室顶端是石墨工作电极，底面是硝酸纤维滤膜与缓冲室相连，缓冲室内为辅助铂电极和参比甘汞电极，使用PAR174极谱分析仪和3033XY记录仪。测试时先将工作电极清洗后放入细胞室，循环扫描至稳定状态，用0.1mo

10、l/L PBS洗涤细胞2次，调整细胞数量达2.5×105后注入细胞室，每次试验重复3次。结 果1HL-60细胞的电子伏安扫描经洗涤后的HL-60细胞悬液以及用于清洗细胞的PBS扫描时显示：扫描速率为50mV/s，HL-60细胞于0.715V出现阳极峰，缓冲液没有波形出现，说明波形不是由于细胞释放的化学物质造成。2HL-60细胞凋亡过程的电化学行为40，200g/ml Vp16作用于HL-60细胞，分别在1，2，3，4小时收集细胞，经PBS清洗后注入细胞敏感池中检测。结果显示，在所观察范围内，随着药物剂量增大及用药时间延长，试验组峰值电流逐渐降低(1)。分别以2200g/ml Vp16

11、处理HL-60细胞24小时，随着药物剂量的增大，DNA电泳及流式细胞术DNA含量分析可观察到逐渐出现的典型DNA梯形条带和亚二倍体凋亡峰（2，3），表明Vp16能有效地诱导HL-60细胞凋亡，同时使用电化学传感器方法检测发现细胞峰值电流逐渐降低（4），表明药物与细胞接触后可影响细胞的电化学行为，此电化学行为的变化与药物作用于细胞的浓度和作用时间有关。    42200g/ml Vp16处理HL-60细胞24小时的峰值电流3HL-60细胞凋亡早期的电化学行为观察Vp16 2g/ml作用于HL-60细胞24小时，细胞电化学活性较对照组已有下降；200g/ml

12、 Vp16作用1小时时已有较明显的峰值电流改变（而此时DNA电泳、DNA含量分析均无凋亡指标）；随着用药时间延长，3小时时峰值电流已降至基础值的75%，而此时DNA含量分析仅有16%细胞为凋亡细胞，提示在细胞凋亡发生的早期阶段（该阶段从形态学上无法观察到）细胞的电化学行为已经发生了变化。4HL-60细胞凋亡和细胞坏死的电化学行为比较以40，200，500g/ml Vp16作用于HL-60细胞4小时，形态学观察、坏死细胞计数以及DNA含量分析显示细胞分别处于存活（活细胞95%）、凋亡（凋亡细胞18%，坏死细胞15%）以及坏死（95%细胞为死细胞）状态，细胞所表现的电子伏安行为是随Vp16剂量增大

13、，峰值电流逐渐降低，分别较对照组下降70%、80%、95%，在细胞凋亡和细胞坏死的过程中，两者的电化学反应一致，说明电化学反应在凋亡早期过程中即可表现出来，但在凋亡晚期和坏死的发展过程中此种反应缺乏特异性。讨论细胞凋亡作为细胞死亡的形式之一，有其典型的形态学和生化特征，对凋亡细胞的确定有赖于这些特征的出现，然而在细胞形态学和DNA改变之前，凋亡细胞早已经进行了包括细胞内离子如Ca离子、酶-辅酶系统活性(如蛋白激酶)等一系列生化反应及生理过程的改变4。多种因素能够诱导细胞凋亡，其机制尚不清楚。由于细胞内的生化反应大都具有电化学性质，细胞内的氧化还原系统所造成的电化学变化可以通过电极表现出来，氧化

14、还原状态不同时，细胞电子传递速率不同，反映出被动电化学行为不同5，6。电化学传感器是利用先进的电子学和光学技术可以记录细胞的生物化学和生物物理反应的过程，已证实应用这种电化学传感器检测细胞的电化学行为具有一定的可识别性和不可逆性。我们采用Vp16处理HL-60细胞株研究发现，在细胞凋亡早期阶段，细胞逐渐发生电化学活性的变化，随着药物剂量增加及用药时间延长，细胞的峰值电流下降，以后继续下降并出现细胞凋亡的其它特征性改变。Vp16极小剂量(2g/ml)时即可反映出峰值电流改变，20g/ml时明显下降，说明应用此方法分析细胞凋亡较常规的形态学和生化等方法更敏感；以200g/ml Vp16诱导细胞凋亡

15、，通过DNA含量分析显示，2，3，4小时时凋亡细胞在10.5%20.0%，但细胞电化学活性改变差异明显，峰值电流从1.8A降至0.4A，4小时时峰值电流降至用药前的1/5，提示在细胞出现明显凋亡形态和DNA链改变之前，细胞可能经历了一个电化学改变的累积过程。我们的研究结果显示细胞的电化学行为可以反映细胞的生理代谢活性，细胞处于不同的活性状态时，其电化学活性亦有差异。使用Vp16诱导HL-60细胞凋亡的电化学变化反映了药物可能影响了细胞电化学信号的传输及氧化还原系统的活性。尽管此方法对检测细胞凋亡晚期和坏死过程缺乏特异性，但深入研究凋亡早期阶段电化学行为，进一步探讨氧化还原系统变化在凋亡启动发生

16、过程中的作用，将有助于认识细胞凋亡的早期机制。作者单位：100044任新萍王德炳（北京医科大学人民医院血液病研究所）；李怀娜慈云祥（北京大学分析化学研究所）参考文献1 Morris RG, Duvall ED, Hargreaves AD, et al. Hormone-induced cell death: surface changes in thymocytes undergoing apoptosis. Am J Pathol, 1984, 115: 426-436.2 Wyllie AH, Kerr JFR, Carrie AR, et al. Cell death: the sig

17、nificance of apoptosis. Intern Rev Cytol, 1980, 68: 251-306.3 Binder C, Hiddemann W. Programmed cell deathmany questions still to be answered. Ann Hematol, 1994, 69: 45-55.4 Allen PD, Bustin SA, Newland AC, et al. The role of apoptosis (programmed cell death) in hemopoiesis and the immune system. Blood Rev, 1993, 7: 63