水通道蛋白-4 与血脑屏障发育及其完整性的关系(一)

1、水通道蛋白-4 与血脑屏障发育及其完整性的关系(一)    水通道蛋白（Aquaporins,AQPs）是介导水跨膜转运的一大膜蛋白家族，分布于高等脊椎动物上皮细胞或内皮细胞。结构上由28-KDa 亚单位组成四聚体，每个亚单位构成孔径约0.38nm的水孔通道，在渗透压驱动下实现水双向跨膜转运【1】。目前11 种亚型已经在哺乳动物中被确定（AQP0-10），各种亚型的体内分布具有组织特异性，其中水通道蛋白-4 (Aquaporin 4,AQP4)以极化形式集中分布于中枢神经系统脑毛细血管周边的星形胶质细胞足突或室管膜细胞【2】。血脑屏障（blood-bra

2、in barrier, BBB）为脑内另一调控水平衡的复合体，由无窗孔的脑毛细血管内皮细胞及细胞间紧密连接、基底膜、星形胶质细胞等组成，介于血液和中枢神经系统（central nervous system,CNS）之间，限制血液中某些离子、大分子物质转移到脑实质，此屏障作用为维持CNS 内环境稳定、保障脑功能正常行使提供了重要保障。BBB 分化发育过程中脑毛细血管内皮细胞间紧密连接的形成虽被认为是其成熟的标志，但BBB 生理功能的实现有赖于各组成成分间的相互作用。近来对星形胶质细胞调控BBB 物质交换和脑内水平衡方面的作用日益受到重视，并认为与AQP4 表达有关。本文就AQP4 与血脑屏障发育

3、及其完整性关系的研究进展作一综述。1.BBB分化发育过程中AQP4 的表达目前由于对鸡胚视顶盖中血管及BBB 分化的研究已较完善，因此常被用于BBB 的研究模型。Nico 及其同事【3】采用免疫细胞化学、分子生物学技术研究了鸡胚视顶盖AQP4 在BBB 分化发育过程的动态表达。免疫电镜显示鸡胚视顶盖发育第9 d，BBB仅由不规则的内皮细胞组成，内皮细胞间紧密连接尚未形成，AQP4 未见表达。待发育至第14 d，Western blot 技术首次在约30 kDa 链附近检测出AQP4 的免疫活性，电镜下显示短的内皮细胞间紧密连接已形成，并串联构成BBB 的微血管，星形胶质细胞间断黏附于血管壁，A

4、QP4 不连续地表达于血管周边，血管周围仍然存在小空隙。发育第20 d BBB 成熟，内皮细胞间紧密连接形成，BBB 微血管被星形胶质细胞紧紧包被，血管周边星形胶质细胞足突上的AQP4 呈现强阳性表达，且冷冻断裂研究显示AQP4 的正交排列阵也同步形成。而在啮齿类动物， BBB 分化发育发生于出生后，AQP4 表达与BBB 发育也表现出一定的同步性。大鼠出生后脑毛细血管呈最大速率增殖，BBB 逐步发育完全，脑内AQP4 的首次检出也恰在出生后（生后第7 d 的小脑内），且随BBB分化发育逐渐增加【4】。以上证据显示不论BBB 于胚胎期发育完全的禽类还是出生后发育完全的啮齿类动物，AQP4 表达

5、与BBB 分化发育都表现出一定意义的同步性，说明脑内水调控与血脑屏障关系密切。2.AQP4 在BBB发育过程中的作用水通道蛋白的表达与BBB生理功能间的联系在胚脑发育过程中得到了很好地体现。啮齿类动物胚脑发育之初，巨大的细胞外间隙（ECS）容纳着大量水和离子，仅通过简单扩散将其转移入血液，ECS 容积改变不明显。随着BBB分化发育，胶质细胞在脑毛细血管外层被膜形成，AQP4表达增多，待到脑发育后期BBB分化发育成熟时，ECS 内水及离子得以高效转运，ECS容积迅速减小，完成了脑的最后发育【4】。为进一步揭示AQP4在BBB发育过程中的作用，研究者【3】采用脂多糖（LPS）破坏发育20 d的鸡胚

6、视顶盖（即发育成熟的BBB）以模拟脑膜脑炎时的病理病变。受LPS影响电镜下BBB形态发生明显改变，内皮细胞间紧密连接被分开，血管周边星形胶质细胞足突明显水肿，AQP4免疫反应活性变微弱且呈间断分布，表明BBB受损时AQP4 也发生相应改变，AQP4是脑水肿发生的关键因素，且BBB与调控水流的AQP4关系密切。3.mdx和mdx3cv模型中BBB结构和AQP4表达的变化mdx模型模拟了人类Duchenne型肌营养不良症（DMD）。此病为X性连锁隐性遗传性肌病，由于编码抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的 DMD基因缺陷（缺失或突变），肌细胞内缺乏dystrophin，导致肌纤维膜细胞骨架功能缺

7、失，产生对称性肌无力、肌萎缩为主要特征的临床症状【5】。近年来该病的细胞膜学说得到多数学者的认同，即肌细胞遗传性某种代谢缺陷使肌纤维膜结构和功能发生改变，因此细胞膜尤其是膜蛋白的研究成为DMD膜假说的重要手段。研究显示mdx小鼠肌纤维膜上AQP4蛋白呈年龄相关性下调，1岁龄成年mdx小鼠较年龄相仿的野生型小鼠AQP4表达下调90以上【6】，脑内AQP4的表达也呈现与年龄相关的下调，同时DMD患者的肌组织活检也显示AQP4表达下调的结果【7】，因此目前认为AQP4表达的改变涉及DMD的发病， mdx模型也因此被用于AQP4的研究。Nico 等【2】研究显示dystrophin 表达缺陷的1820

8、 个月龄的mdx 小鼠BBB 形态改变明显，内皮细胞间紧密连接断裂，细胞旁及细胞间转运增加，血管周围星形胶质细胞水肿，AQP4 表达下调，BBB渗透性增加，血管源性水肿形成。进一步研究显示BBB 改变始于mdx 小鼠出生前，即肌肉病理特征尚未表现时，表达于内皮细胞胞膜的细胞间紧密连接相关蛋白ZO1 下调并移位至胞浆，影响细胞间紧密连接的形成，GFAP（星形胶质细胞表面的一种标志物）下调，星形胶质细胞减少，AQP4 表达也下调，血管渗透性增加【8】。mdx模型说明BBB 完整性和星形胶质细胞调控水转运的作用密切相关，同时也说明脑内AQP4 的定位有赖于dystrophin 蛋白。脑内dystro

9、phin 蛋白包括DP140、DP71 及长链dystrophin DP427，以DP71 为主。由于mdx 模型并不影响DP71 表达，遂采用敲除DP71 的mdx3cv模型进一步研究。mdx3cv模型中2 月龄小鼠即出现AQP4 表达下调，较mdx 小鼠提前出现。免疫组化显示mdx3cv小鼠脑皮质血管周围的大量星形胶质细胞足突甚至没有AQP4 染色，免疫金结果进一步明确显示肿胀的星形胶质细胞足突出现极少的AQP4 金颗粒，且少量AQP4 金颗粒移位至神经纤维周边的星形胶质细胞膜。AQP4 在mdx3cv小鼠模型的表达改变也说明DP71 对其在脑内的准确、稳定定位起关键作用。4.AQP4与B

10、BB完整性的关系DMD、颅脑机械损伤、神经系统损伤、化脓性脑病、颅脑肿瘤、永久性脑缺血或短暂性脑缺血再灌注损伤等病变多伴有BBB损伤、脑血管渗透性增加及血管源性水肿，而AQP4在其中的上调或下调表达不一【9,10,11,12】，以致难以明确AQP4上调或下调与水肿形成或消退的关系。AQP4上调是引起水肿的早期原因抑或是水肿发生后促进水肿液排出的反应，AQP4下调阻止了水肿液清除而致水肿抑或是AQP4下调是抑制水肿恶化的机体防御反应？mdx、mdx3cv小鼠AQP4表达下调同时血管周边星形胶质细胞水肿【13】，说明生理情况下AQP4下调可能促进水肿形成。水中毒情况下，敲除AQP4基因模型及mdx

11、模型较野生型动物更易抑制脑水肿形成【13,14,15】，说明水中毒病理情况下AQP4下调可能抑制脑水肿形成。病理和生理情况下渗透梯度的改变或许可以解释AQP4此截然相反的作用。生理情况下，由于AQP4与内在整流性K通道（Kir 4.1）共定位，使脑实质内水及神经元放电活动释放出的K被及时清除入血流，确保神经信号的正常传导和脑内环境的渗透平衡【13,16】，因此认为生理情况下水通过AQP4从脑实质流向血液，而AQP4缺乏或减少则阻碍水正常清除导致脑水肿。相反，在脑水平衡失调的病理情况下，脑内水从血流反向流入脑实质，AQP4上调则促进脑水肿形成，抑制其表达则抑制水肿形成。5. AQP4在星形胶质细

12、胞-血管内皮细胞混合培养体系中的表达细胞培养是胶质细胞内皮细胞间相互作用体外研究的良好工具【17,18】。免疫荧光分析显示AQP4主要表达于星形胶质细胞离体培养系中的质膜，不同于在体脑内星形胶质细胞足突上的极化分布，提示 BBB可能调控AQP4的分布【19】。大量研究已经证明星形胶质细胞和血管内皮细胞间具有相互调控作用【20,21,22】，而多数研究仅针对星形胶质细胞对内皮细胞的影响，为证实内皮细胞会影响星形胶质细胞单细胞培养系中AQP4的分布，研究者将小鼠脑毛细血管内皮细胞bEnd3平置于取自小鼠或大鼠的星形胶质细胞单细胞培养体系中，使两类细胞直接接触以混合培养。和bEnd3内皮细胞共培养714d后，星形胶质细胞和内皮细胞形态都发生明显改变。星形胶质细胞由扁平、单一的融合层转变成由延伸的多细胞柱和肥厚的足突构成的岛屿状，内皮细胞形成毛细血管样结构。而bEnd3内皮细胞单细胞系培养时并无上述改变，证明内皮细胞和星形胶质细胞间的确存在信息交流。免疫荧光分析技术进一步显示，与星形胶质细胞单细胞培养系相比，混合培养体系中AQP4免疫染色增强，且极化分布于靠近内皮细胞、GFAP阳性的星形胶质细胞足突，极少或没有表达于质膜或细胞内【23】，