新城鸡瘟病毒修饰自体肿瘤细胞疫苗在28例中晚期宫颈癌的应用

1、新城鸡瘟病毒修饰自体肿瘤细胞疫苗在28例中晚期宫颈癌的应用        【摘要】     目的 探讨新城鸡瘟病毒修饰自体肿瘤细胞疫苗(NDV-ATV)在中、晚期宫颈癌治疗中的作用。方法 28例宫颈癌行NDV-ATV免疫治疗和放射治疗（实验组），30例单纯接受放射治疗（对照组）。采用流式细胞术观察患者在接受免疫治疗前后外周血中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值变化以及放射治疗的近期疗效、毒副反应等。结果 实验组28例中、晚期宫颈癌患者经治疗12个疗程后，其C

2、D4+、CD4+/CD8+比值较治疗前显著增加（P0.05)，同时CD8+数量较治疗前降低(P0.05)，放射治疗近期疗效较对照组好（P0.05)，毒副反应轻。结论 新城鸡瘟病毒修饰自体肿瘤细胞疫苗能增强患者免疫功能，对放射治疗有协同作用。     【关键词】  新城鸡瘟病毒 自体疫苗 免疫功能 宫颈肿瘤        Application of New castle Disease Virus-Modified Autologous Tumor Vaccine in 28

3、 Cases with Advanced Cervical Carcinoma    JIANG Lian-ping, ZHAO Yu-ping, WANG Yi    (The Second Peoples Hospital in Wenzhou, Wenzhou Tumor Hospital, Wenzhou 325000, China)    Abstract: Purpose To explore the role of New castle disease virus-modified auto

4、logous tumor vaccine(NDV-ATV) for treating advanced cervical carcinoma. Methods Twenty-eight cases with cervical carcinoma underwent NDV-ATV immunotherapy combined with radiotherapy (experimental group), and 30 cases underwent radiotherapy alone(control group). The changes of CD4+, CD8+ and CD4+/CD8

5、+ in the peripherical blood were measured by flow cytometry. Short-term effects of radiotherapy and its side effects were investigated. Results After one to two courses of the therapy for 28 cases with advanced cervical carcinoma, the levels of CD4+ and ratio of CD4+/CD8+ significantly increased tha

6、n those before treatment (P0.05）, and CD8+ significantly decreased than that before the therapy (P0.05）. The short-term effects of radiotherapy in experimental group was better than that in control group (P0.05） with mild side effects in former group. Conclusions New castle disease virus-modified au

7、tologous tumor vaccine (NDV-ATV) enhances the immunity in cervical carcinoma and synergistically with radiotherapy.    Key words: New castle disease virus; autologous tumor vaccine; immunologic function; cervical neoplasms    进入21世纪，以免疫治疗为代表的生物治疗已成为肿瘤治疗的第四种模式。其中肿瘤的主动免疫治

8、疗是指给机体输入具有抗原的疫苗，刺激机体免疫系统产生抗肿瘤免疫以治疗肿瘤的方法。新城鸡瘟病毒修饰自体肿瘤细胞疫苗（New castle disease virus?鄄modified autologous tumor vaccine，NDV?鄄ATV）对恶性肿瘤的放射治疗具有协同作用，本文探讨其在宫颈癌治疗中的价值。    1   材料与方法    1.1   一般资料    对2004年5月到2006年1月收治的B期以上宫颈癌患者行放射治疗+NDV?鄄ATV治疗共

9、28例为实验组；与同期住院一般资料相仿单独行放射治疗B期以上宫颈癌患者30例作为对照组比较。所有的病例均经病理检查确诊，按1995年FIGO标准进行临床分期。实验组：B期16例，期11例，期1例；鳞癌25例，腺癌3例；平均年龄54.2岁；对照组：B期18例，期11例，期1例；鳞癌26例，腺癌4例；平均年龄53.6岁。两组资料具可比性，P0.05。    1.2   方   法    1.2.1   疫苗制备    组成：1号液（细胞活性检测液）1

10、ml，2号液（处理剂A）1ml，3号液（处理剂B）2ml，4号液（细胞稳定剂）5ml，5号液（防菌剂）5ml，6号液（检菌剂）5ml。    所用药液均按GMP标准生产、安全可靠。贮存：4，保存期6个月；-20，保存期24个月。    操作步骤：取瘤组织12g，用注射用生理盐水（以下简称生理盐水）冲洗干净，剪除癌旁组织。以锐利刀剪切成5mm3碎块，置于生理盐水中。用100目钢网挤滤，收集细胞悬液。离心(800r/min，10min)，弃上清。生理盐水洗(每次洗后800r/min，离心10min)2次，稀释成12ml细胞悬液。计数活瘤细

11、胞：取滴细胞悬液和1滴1号液混匀，放置3min，然后取1滴染色混合细胞悬液于血细胞计数盘内，按白细胞计数法计数四大方格内未蓝染之瘤细胞(即活瘤细胞)。用下式计算：活瘤细胞/ml=总数×2.5×1000(×稀释倍数)。取 2×108细胞，加入2号液1ml，于50%CO2培养箱中37孵育1h。生理盐水洗(每次洗后800r/min离心10min)2次，稀释成12ml的悬液。加等量3号液，轻轻混匀，室温下置40min。生理盐水洗2次，每次洗后800r/min，离心10min，弃上清。加等量4号液，轻轻混匀，室温下置20min。生理盐水洗2次(每次洗后 800r/

12、min，离心10min)。取5号液5ml按（1×1072×107/0.5ml)，稀释成细胞悬液，4保存。取6号液5ml于培养瓶：接种100l瘤苗于瓶中液体，37培养3d，检测有无细菌生长。无菌检验合格瘤苗即可等量分装成48支，每支1ml包装、备用。    1.2.2   免疫接种     接种前1周给病人静脉点滴环磷酰胺400mg进行免疫调动。免疫调动1周后开始接种，每周1次，共4次为1个疗程。首次免疫(第一疗程)选择患者前臂或肩三角区(也可在下腹股沟部皮肤)淋巴引流区域皮肤，进行三点

13、注射，每点相距 35cm，皮内一点约0.2ml，皮下两点，每点约0.4ml。首次免疫治疗后一个月，进行强化免疫（第二疗程），方法同上。    1.2.3   放射治疗     免疫接种第一次后，开始进行放射治疗，采用美国瓦里安公司生产的6MV直线加速器进行体外照射，先行全盆对穿照射，上界在L4L5椎体间，下界达闭孔下缘，侧界以真骨盆外1cm矩形野照射，剂量DT2530Gy，然后中线挡铅(前宽4cm，后宽6cm)对穿照射，DT剂量2025Gy。常规放疗：每次照射2Gy,每周5次，总剂量 DT4555Gy。腔

14、内治疗：采用192Ir高剂量率后装治疗机，在完成全盆照射 DT2030Gy后，就开始腔内放疗，腔内放疗当日停外照射1次。腔内照射每周1次，每次照射A点剂量6Gy，共计56次。A点肿瘤量DT3036Gy。治疗时阴道增宽棉球尽量使施源器位于中平面，以减少直肠及膀胱受量。    1.3   观察指标     采用贝科曼公司生产的FACS流式细胞仪及相应单抗检测患者在治疗前及治疗23周后外周血中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+免疫指标变化。    放射治疗的近期疗效评定标准按W

15、HO(1981)标准1，完全缓解(CR)：所有的症状、体症完全消失至少4周;部分缓解(PR)：肿瘤大小约减少50%至少4周。未愈(NC)：无明显变化，肿瘤大小减少50% 或出现新病灶。    1.4   统计学方法    数据采用均值±标准差表示，两样本率的比较采用2检验，以P<0.05为有显著性差异。    2   结   果    2.1   实验组、对照组外周血免疫指标变化&

16、#160;   由表1可见，实验组治疗前后数值差异有显著性（P0.05)。提示进行NDV?鄄ATV接种后，外周血中CD4+、CD4+/CD8+比值显著增加，CD8+细胞数量降低。可增强患者免疫功能。    由表2可见，治疗前后免疫指标数值无显著性差异（P0.05)，提示单纯放射治疗不提高患者免疫功能。    2.2   两组患者放射治疗近期疗效及毒副反应情况    由表3可见，两组间放射治疗的临床治愈率差异有显著性意义(P0.05)，提示放射治疗加 NDV?鄄ATV

17、主动免疫治疗能提高患者临床近期疗效。    实验组中有2例接种后皮肤出现红、肿，直径0.7cm，无溃疡形成，无需特殊处理，均自行消失。两组放射治疗过程中均有出现轻微里急后重感，经思密达冲剂口服后消失；实验组中无1例白细胞下降，对照组中有2例白细胞下降，两组毒副反应差异无显著性。NDV?鄄ATV不影响放射治疗的进行。    3   讨   论    新城鸡瘟病毒(New castle disease virus，NDV)属一种禽类的副黏液病毒，能选择性感染肿瘤细胞，对

18、人体无毒无害。新城鸡瘟病毒修饰的自体肿瘤细胞疫苗，NDV?鄄ATV是以肿瘤细胞为靶细胞，以天然病毒新城鸡瘟病毒(NDV)为载体，通过病毒对靶细胞自然感染，达到人类有目的的“转基因”效果。新鲜分离的肿瘤细胞具有多种潜在的肿瘤相关抗原，用NDV与其融合制备而成的疫苗，由于NDV病毒含有具有融合活性的融合蛋白F和神经氨酸酶HN，通过其与肿瘤细胞结合，改变了肿瘤细胞表面形态，使机体免疫系统得以识别。利用新城鸡瘟病毒治疗肿瘤的主动特异性免疫治疗，作为有效肿瘤疫苗的生物佐剂，联合运用疫苗来表达肿瘤相关抗原的特异组分和增加肿瘤细胞免疫原的非特异组分。新城鸡瘟病毒修饰自体肿瘤疫苗的制备采用患者自体的肿瘤组织，

19、经过病毒感染修饰后的肿瘤细胞，发生了两个方面的转变：一是病毒的感染增强了肿瘤的免疫原性，二是具有直接向T淋巴细胞呈递抗原能力2。新城鸡瘟病毒是一种有效安全的增殖病毒，它不能在正常细胞内复制，所以对人无感染性，同时其携有肿瘤特异性相关抗原，能够被机体免疫系统识别，从而引起机体的免疫应答反应，使患者的免疫系统得以重建。肿瘤的免疫疗法是以激发和增强肿瘤宿主的免疫功能，以达到控制和杀灭肿瘤细胞的目的。免疫调节细胞主要有诱导性T淋巴细胞(CD4+)和杀伤性T淋巴细胞(CD8+)。研究发现，CD4+/CD8+细胞比值是决定机体免疫状态和免疫应答的中心环节。一般认为，肿瘤患者由于细胞免疫功能受到损害，体内的

20、CD4+细胞减少，同时CD8+增多，而且随着病情的进展，其外周血中CD4+/CD8+降低，甚至倒置。在接受新城鸡瘟病毒修饰的自体肿瘤疫苗主动特异性免疫疗法后，总T淋巴细胞CD4+增加，CD8+降低，CD4+/CD8+细胞比值恢复正常，表明患者自身细胞免疫调节功能得以恢复和提高3，也表明患者免疫功能有所增强。      本实验通过对放射治疗+NDV?鄄ATV组与单独放射治疗组比较，发现实验组治疗后CD4+、CD4+/CD8+数值升高，CD8+数值降低，而对照组无明显变化，表明NDV?鄄ATV能提高和恢复患者的细胞免疫功能，对放射治疗有协同性，使放

21、射治疗的近期疗效明显提高，并且毒副反应轻，不影响放射治疗的进行，是一种安全的辅助治疗手段，与国内外报道一致4。随着肿瘤生物治疗技术的发展，该方法将更加完善，最终造福于广大癌症患者。    【参考文献】  1    孙燕. 临床肿瘤内科手册M. 第4版.北京：人民卫生出版社, 2003. 106.    2    Kirchner HH,Anton P, Atzpodien J. Adjuvant treatment of locally advanced renal cancer with autologous virus modified tumor vaccinesJ. World Urol, 1995, 13(3):171.    3    邝国乾, 张奕敬, 丘惠芬, 等. 新城鸡瘟病毒疫苗免疫治疗45例肿瘤患者的近期毒副反应J. 广西医科大学学报, 1998, 15（1）：111.    4