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1、    人参皂苷Rg1对MPTP所致亚急性帕金森病模型小鼠中脑黒质pcJun与COX2表达的影响人参皂苷Rg1对MPTP所致亚急性帕金森病模型小鼠中脑黒质pcJun与COX2表达的影响 王永生1李会2张宇新1*韦淑萍2张作风1田青友1（华北煤炭医学院1基础医学部；2附属医院， 唐山 063000）摘要  本文研究了人参皂苷Rg1（Ginsenoside Rg1, Rg1）对1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶（1methyl4phenyl1,2,3,6tetrahydropyridine, MPTP）所致亚急性Parkinson病(PD)模型小鼠

2、中脑黒质磷酸化cJun（pcJun）与环氧合酶2（cyclooxygenase2, COX2）表达的影响，以期探讨Rg1保护PD中脑黑质多巴胺（DA）能神经元可能的分子机制。实验采用MPTP制备亚急性PD小鼠模型。通过行为学观察，免疫组织化学SP法和免疫蛋白印迹法，观察PD模型小鼠行为学变化，中脑黑质酪氨酸羟化酶（TH）、COX2和pcJun表达水平的变化，并观察给予人参皂苷Rg1对上述变化的影响。结果显示，模型小鼠出现典型PD样症状。与对照组小鼠相比，黑质区TH阳性神经元数下降约65%（P0.001），TH表达水平显著降低约75%；黑质区COX2阳性细胞明显增多，pcJun特异性表达于黑质区

3、细胞核内，且COX2与pcJun表达水平均明显升高。经Rg1（10 mg/kg）处理后，模型小鼠PD样症状减轻，与对照组比较，在MPTP第5次注射后7 d，TH阳性细胞数和TH表达水平仅下降约15%和20%；与模型组比较，黑质区COX2阳性细胞明显减少，pcJun主要表达于细胞浆，部分表达于细胞核，表达水平也明显降低。以上实验结果表明，人参皂苷Rg1对MPTP诱导的亚急性Parkinson病小鼠中脑黑质细胞的神经保护作用可能是通过阻抑pcJun核内表达，从而减弱COX2表达及其介导的黒质区炎症反应。关键词   Parkinson病人参皂苷Rg1炎症环氧合酶2磷酸化cJunC

4、57BL/6N小鼠Influence of Ginsenoside Rg1 on pcJun and COX2 expression in substantia nigra of the MPTP mouse model of subacute Parkinsons disease Wang Yongsheng1, Li Hui2, Zhang Yuxin1, Wei Shuping2, Zhang Zuofeng1, Tian Qingyou1 (1Department of Basic Medicine and the affiliated hospital, 2North China C

5、oal Medical College, Tangshan 063000) AbstractTo investigate the effect of Ginsenoside Rg1 (Rg1) on the expression of pcJun and COX2 in substantia nigra (SN) of the MPTP mouse model of subacute PD and further explore the possible protective mechanism of it on DA neuronal death in PD, C57BL/6N mice w

6、ere administrated with MPTP to produce subacute PD model. By using inmmunohistochemistry and Western blot , we observed the expression changes of TH, COX2 and pcJun in SN of the midbrain. The above changes, after giving Rg1, were also studied. Meanwhile, the behavioral changes of PD mice were observ

7、ed after MPTP and Rg1 injections. Our results suggest that compared with the mice in control group, the PD mice had the typical symptoms of PD. The number of THpositive neurons and expression level of TH in model group were distinctly reduced by about 65% and 75% (P0.001) in the substantia nigra at

8、7 d after the fifth injection of MPTP. The number of COX2 positive cells were significantly increased and pcJun was specially expressed in the nuclei of neurons in SN; the expression level of pcJun and COX2 was greatly increased in SN of midbrain. But in Rg1 group, the PD mice administrated by Rg1 h

9、ad slight behavioral symptoms. The number of THpositive neurons and the expression level of TH in SN were only decreased by 15% and 20% as compared with the control group (P0.001) at 7 d after the fifth injection of MPTP. The number of COX2 positive cells were clearly reduced as compared with the mo

10、del group, pcJun was mainly expressed in the cytoplasm of neurons with a little in the nucleus; the expression level of pcJun and COX2 in SN was clearly decreased at 6 h after the third injection of MPTP. The above results showed that the neuroprotective mechanism of Rg1 might be mediated by blockin

11、g the expression of pcJun in nucleus and then attenuating the inflammation reaction induced by COX2 expression in SN in the MPTP mouse model of subacute PD.Key wordsParkinsons disease, Ginsenoside Rg1, inflammation, COX2, pcJun, C57BL/6N mice    Parkinson病(PD)是一种老年人常见的神经系统退变性疾病，其主要神经病

12、理学改变是中脑黑质DA能神经元进行性变性缺失，迄今为止，病因及发病机制不详。许多的研究表明，炎症与PD发病关系密切，炎症反应可能是中脑黒质DA能神经元进行性变性缺失的病理基础，炎症反应及其诱发的一系列细胞生物学方面的变化可能是PD进行性加重的自然病程的根本原因15，因此抗炎药物的研制日益受到人们的关注。人参皂苷Rg1是中药人参中主要的生物活性成分，其作用的主要靶器官是中枢神经系统6。诸多研究已利用动物模型与细胞模型从不同角度证实了其治疗和改善PD的作用79，但人参皂苷Rg1在治疗和改善PD作用过程中是否具有抗炎机制及其具体的分子作用途径仍不清楚。本研究采用MPTP制备亚急性PD模型，观察中脑黑

13、质炎症性标志酶COX2、核转录因子pcJun与DA能神经元特异性标志物TH的表达关系，并观察给予人参皂苷Rg1对上述表达的影响，探讨人参皂苷Rg1保护DA能神经元的作用是否与pcJun和COX2表达有关，以期为人参皂苷Rg1临床治疗PD在分子水平上提供一定的科学理论依据。材料和方法1.材料  健康雄性C57BL/6N小鼠45只，812周龄，体质量2530 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，自由进食饮水，室温(25±2)，单笼喂养，自然光照。MPTP（Sigma）,兔抗人COX2单克隆抗体（福州迈新生物），小鼠抗人TH单克隆抗体（Chemicon），兔抗人pcJun单

14、克隆抗体（Ser63, Cell Signaling Technology），人参皂苷Rg1（吉林大学）, UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒（福州迈新生物）。2.方法2.1动物分组和模型制备  实验动物随机分为3组，每组15只。模型组：腹腔注射MPTP（30 mg/kg，生理盐水溶），1次/d，连续5 d；。人参皂甙Rg1组：MPTP注射前3 d腹腔注射Rgl（10 mg/kg），1次d，连续3 d，随后在每日注射MPTP前23 h注射1次Rg1；对照组：注射与模型组和抑制剂组等体积的生理盐水。于每次注射药物后观察小鼠行为变化, 以判断PD鼠模型是否成功。2.2标本采集

15、  动物分别于MPTP第3次注射后6 h和MPTP最后1次注射后7 d处死。动物麻醉后，行40 g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液常规灌注固定，迅速开颅取脑，40 g/L多聚甲醛后固定48 h（4），石蜡包埋、切片。MPTP第3次注射后6 h所取标本用于观察COX2与pcJun脑组织切片常规脱蜡至水后，用TBST（pH7.4±0.2）洗3次，每次3 min；组织抗原行水浴法热修复；3%过氧化氢阻断内源过氧化物酶，TBST洗3次；用正常非免疫动物血清室温孵育10 min；同一组织相邻切片分别加入兔抗人COX2单克隆抗体（1100）、小鼠抗人TH单克隆抗体（1400)、兔抗人pcJun

16、抗体（Ser63,1100），4过夜；TBST洗3次后，加入生物素标记第二抗体室温孵育20 min；TBST洗3次，加入链霉素抗生物素蛋白小鼠麻醉后取脑，分离中脑黑质部分，置入细胞裂解液中，低温匀浆，4震荡作用30 min后，12 000 g 4离心15 min，取上清，-80保存备用。蛋白定量后加入4倍体积样本缓冲液，95变性5 min。取20 g样品在100 g/L十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上电泳完，电转至硝酸纤维素膜，依分子质量大小切取条带，取相应条带分别加入COX2单抗（1400）、pcJun单抗（1200）和TH单抗（11 000），4过夜。TBST冲洗后，分别与生物素标记的羊抗兔

17、/小鼠IgG抗血清（1200）室温震荡孵育2 h。TBST洗涤后，与卵白素辣根过氧化物酶复合物室温下孵育0.5 h，DAB显色。将特异性蛋白条带用扫描仪扫描，在同一条件应用CMIAS真彩医学图像分析系统测定条带平均灰度值。3.统计学处理  模型小鼠于第1次注药后1020 min均出现不同程度的震颤、竖毛、翘尾，MPTP最后1次注射后，模型鼠出现活动减少、动作变慢等症状；对照组未出现上述行为学变化；人参皂苷Rg1组与模型组比较上述行为学症状减轻，7 d后与对照组小鼠比较运动功能无明显差别。2.免疫组化检测 对照组中脑黑质区可见大量TH阳性神经元，排列整齐，呈条带状（Fig.1），偶见C

18、OX2和pcJun免疫阳性细胞散在分布且pcJun微量表达于胞浆。模型组与对照组相比，可见TH阳性细胞减少约65%（Fig.1，表1），黑质区可见COX2和pcJun免疫阳性细胞明显增多且pcJun主要表达于细胞核（Fig.2）。人参皂甙Rg1组，TH阳性神经元的丢失较模型组明显为轻，仅较对照组减少约20%（Fig. 1）；pcJun主要表达于胞浆，部分表达于胞核；黑质区COX2阳性细胞明显减少。图像分析结果显示，差异有统计学意义（P0.01）（Figs. 1, 2，表1）。3.Western blot检测  在预染蛋白标准约Mr 48 000、72 000和61 000处，分别可见

19、pcJun、COX2和TH特异性蛋白条带。灰度分析发现，与对照组比较，模型组pcJun和COX2的表达均明显升高，TH表达显著降低（Fig.3），灰度差异均有统计学意义（P0.01，表2）。人参皂甙Rg1组与模型组比较，pcJun和COX2的表达均降低，TH表达明显增高（Fig.3），差异有统计学意义（P0.01，表2）。对照组仅有微量pcJun和COX2的表达。讨论PD是一种以静止性震颤、运动迟缓和姿势步态异常等为主要临床表现和以中脑黑质致密部多巴胺能神经元变性丢失为主要神经病理学特征的神经系统退变性疾病。本研究复制的PD模型具有典型的行为学表现；实验结果显示中脑黑质致密部TH免疫阳性细胞明

20、显减少，中脑黑质TH蛋白表达下降，这提示本实验动物中脑黑质存在DA能神经元大量丢失，本实验采用的动物模型符合实验要求10。大量研究表明，PD可能与炎症密切相关，炎症可能是PD患者黑质多巴胺能神经元缺失的重要原因1。C0X2是炎症介质前列腺素E2合成的限速酶，可作为炎症反应的重要生物学指标24。人参皂苷Rg1是近年来研究较多的中药人参的主要生物活性成分，药理研究表明它对PD中脑黒质DA能神经元具有抗氧化、抗凋亡和抗衰老等多种神经保护作用6，但迄今为止，人参皂苷Rg1保护神经元的作用中是否存在抗炎机制及其具体的分子作用机制不详。为明确人参皂苷Rg1保护DA能神经元的作用机制，本实验观察了中脑黒质C

21、OX2与TH的表达情况。实验结果显示，PD小鼠中脑黑质COX2水平明显升高，黒质区COX2免疫阳性细胞明显增多，同时存在TH阳性神经元大量缺失，中脑黑质TH表达水平明显降低。经人参皂苷Rg1预处理后，PD小鼠中脑黒质COX2表达水平降低，黒质区COX2免疫阳性细胞减少，同时TH阳性神经元缺失明显减少。这提示，中脑黑质区DA能神经元大量缺失可能与黑质COX2大量表达密切相关，人参皂苷Rg1保护中脑黒质DA能神经元可能是通过下调了COX2表达及其介导的炎症反应。  近年有资料表明，磷酸化cJun可能与炎症反应关系密切并与PD发病密切相关11,12。一般认为，磷酸化cJun是JNK信号通路

22、的活性底物，JNK激酶在氧化应激等条件下被激活并磷酸化其特异性底物cJun核转录因子，pcJun进入核内形成AP1进而影响基因的表达调控13。为进一步明确人参皂苷Rg1保护中脑黒质DA能神经元的抗炎分子作用途径，本实验观察了pcJun在中脑黑质的表达情况。实验结果提示，PD小鼠中脑黑质pcJun表达水平明显升高，且pcJun主要表达于黒质区细胞核内，同时存在COX2表达水平明显升高，TH阳性神经元大量缺失；经人参皂苷Rg1预处理后，PD小鼠中脑黒质pcJun表达水平降低，且pcJun主要表达于黒质区细胞浆内，同时COX2表达显著降低。这表明，人参皂苷Rg1保护中脑黒质DA能神经元的抗炎机制与p

23、cJun核移位表达密切相关。本实验的前期工作证实5,14，MPTP可导致DA能神经元内JNK信号通路激活，pcJun出现核移位，由胞质进入胞核并上调COX2表达，COX2介导的炎症反应可进一步引起中脑黒质细胞凋亡，因此，pcJun表达可能是MPTP所致亚急性PD模型中脑黑质COX2表达及其介导的炎症反应的重要上游事件。上述实验结果表明，人参皂苷Rg1可在一定程度上阻抑pcJun核移位表达而干扰JNK信号通路，使其不能上调COX2表达，从而降低黑质区COX2介导的炎症反应及其诱导的细胞凋亡，使黑质DA能神经元免于MPTP诱导的损伤，最终使该模型小鼠运动功能障碍得到改善。参考文献 1 Marche

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