论文实例：透明质酸在腹膜透析中作用的机理研究

1、论文实例：透明质酸在腹膜透析中作用的机理研究        作者简介：郭群英，女，1972年05月出生，1998年09月师从于中山大学叶任高教授，于2001年07月获博士学位。摘要腹膜透析,特别是持续性不卧床腹膜透析（continuousambulatoryperitonealdialysis,CAPD）是慢性肾功能衰竭的主要治疗方法之一。超滤失败是目前导致透析不充分乃至腹膜透析失败的重要原因。如何预防腹膜超滤功能下降,有效地保护持续性腹膜透析中的腹膜功能,是腹膜透析研究的热点。目前临床尚无有效防止超滤失败的渗透压

2、制剂或药物。透明质酸是一种由双糖单位N-乙酰葡糖胺和葡醛酸重复连接构成的多糖。我们以前的研究发现,在急性大鼠腹膜透析模型中应用透明质酸可以有效地增加超滤量，增加尿素氮的清除率,减少蛋白质丢失，而且这种作用与其分子量和其在透析液中的浓度密切相关。透明质酸的作用机理目前还不清楚。有研究表明，腹膜表面可能存在一层由腹膜间皮细胞分泌的透明质酸、磷脂所形成的表面活性层，而且这一层可能在腹膜转运，特别是腹膜水转运中起很重要的作用。通过振动腹腔来破坏这一液体层可增高腹膜的通透性。我们推测,长期腹透过程中，腹透液的冲刷可使这一表面活性层结构破坏，腹膜失去其表面这一极为重要的疏水层后功能发生改变，对水通透性增加

3、，腹腔液体重吸收增加，从而导致超滤功能下降。透析液中加入的大分子量透明质酸（外源性透明质酸）在腹腔静水压作用下，与内源性透明质酸层一起在腹膜表面形成一层保护膜（restrictfiltercake）,保护其免受非生理性腹透液损害,并有降低腹膜通透性的作用,从而减少腹腔液体吸收,增加超滤量，维护腹膜功能。虽然透明质酸在大鼠急性腹膜透析模型中显示了较好的效能，但其在大鼠慢性腹膜透析中的作用、持续性应用透明质酸后腹膜功能将如何变化尚不肯定。尽管国际腹透界对腹膜表面活性层有种种猜测，并通过对腹膜间皮细胞（MPCs）研究，间接证实了该层的存在，然而，至今仍未有形态学证据。Heldin的研究早已证实人间皮

4、细胞(HMCs)能合成大量透明质酸（HA），新合成的HA在细胞外形成一环绕细胞的胞衣结构，对细胞有保护作用。最近研究已证实哺乳动物有三种透明质酸合成酶基因HAS-1、HAS-2、HAS-3，这三个基因的产物透明质酸合成酶1(HAS-1)、HAS-2和HAS-3在氨基酸序列和分子结构特征上有很大的同源性。虽然酶学特征各有不同，这三种酶都可以在细胞膜内侧面催化透明质酸链合成，但他们催化合成的HA链的长度却各不相同。HAS1和HAS2蛋白催化合成大分子量的HA，HAS-3则催化合成较短的HA链。不同分子量的HA对细胞功能有不同的影响。不断延长的透明质酸链伸出细胞膜外，成为细胞基质（胞衣样结构）的骨架

5、。哪一种透明质酸合成酶是人腹膜间皮细胞（HPMCs）透明质酸合成的关键酶？炎症因子、各种腹膜透析液渗透压制剂对HPMCs透明质酸合成有什么影响？如前所述，透明质酸的作用与其分子量相关，不同分子量的外源性透明质酸对HPMCs内源性的透明质酸合成有什么影响？所有这些问题均未见报道。为探讨这些国内外尚未解决的问题，我们设计并进行了以下研究：一透明质酸在大鼠慢性腹膜透析模型中的作用为了解透明质酸在大鼠慢性腹膜透析中的作用及腹膜功能变化，进行以下研究：20只雄性SD大鼠随机分为3组。高糖组（n=8）和透明质酸组(n=6)每天分别腹腔内注射25ml的4.25葡萄糖腹膜透析液或含0.025透明质酸(分子量为

6、1.6×106道尔顿)的4.25葡萄糖腹膜透析液,共7天;正常对照组(n=6),不进行腹腔注射。第8天进行4h腹膜功能实验并于不同时点留取血和腹透液样品进行分析。结果如下：高糖组和透明质酸组的腹腔内容积(IPV)显著低于正常对照组(P值均<0.01)；然而,透明质酸组IPV仍显著高于高糖组(P<0.01)。高糖组腹腔液体吸收率(KE)显著高于正常对照组和透明质酸组（P<0.05）,而后两者差异无显著性。高糖组和透明质酸组的淋巴液体吸收率(KEB)均显著高于对照组(P0.05）。高糖组尿素钠总蛋白D/P值均显著高于其他两组(P均<0.05）；高糖组蛋白质清除率明

7、显高于其它两组（P<0.05）。高糖组葡萄糖,尿素,钠,钾和总蛋白弥散转运系数(KBD)均显著高于其他两组相应值。这一结果提示高糖透析液可引起腹膜通透性增高，而持续性应用透明质酸可以防止高糖引起的腹膜通透性增高。        二1腹膜表面超微结构的观察及透明质酸的免疫电镜研究为证实大鼠腹膜表面活性层存在并探讨其可能组成成分，从4只SD大鼠取正常的大鼠腹膜组织，分别采用下列固定方法固定24小时：(1)2.5戊二醛和2多聚甲醛(对照组)；(2)2.5戊二醛和0.5氯化十六烷基吡啶(GAG组)，后者用于固定葡糖胺

8、聚糖；(3)2OSO4用于固定磷脂(PH1组)；(4)4OsO4(PH2组)；(5)3鞣酸（鞣酸组）。漂洗后，GAG组以2OsO4,PH1、PH2组以2.5戊二醛及0.25鞣酸，鞣酸组以1OsO4作后固定处理。标本以梯度浓度的酒精及丙酮脱水处理，以Epon812包埋，超薄切片，以透射电镜(HITACHI-600)观察。为证实腹膜表面层中存在透明质酸，将12个200目镍网分别轻轻接触大鼠腹膜表面秒后进行固定：甲醛蒸汽5min，400C烤箱30min，T冲洗15min×3次；然后行透明质酸（HA）免疫电镜检查，其中6个以T代替HA一抗作为阴性对照组，另6个为实验组。结果如下：在对照组中，

9、可见腹膜间皮层表面的微绒毛而未观察到腹膜表面液体层。GAG组中，在腹膜表面可观察到一层不连续的无定形结构层。PH1组中，一层连续的无定形结构覆盖于腹膜表面，它们的厚度与微绒毛的疏密相关。这一层在PH2组中被较好的保存，最厚处达到10m。鞣酸组中，不但可以清晰见到此层，而且在此层及间皮细胞中还可以见到多量的类板层小体。透明质酸免疫电镜研究发现：实验组可见网格状腹膜表面层结构，并见阳性信号；对照组未见阳性信号。这提示正常大鼠腹膜表面存在一模样结构，该层中含有透明质酸并可能含有磷脂。三透明质酸合成酶（HAS）在人腹膜间皮细胞（HPMCs）细胞外基质/细胞衣样结构（Matrixorextracellu

10、larcoatorhyaluronancontainingcoat）合成中的作用为确定三种透明质酸合成酶（HAS）中，那一种是人腹膜间皮细胞（HPMCs）合成透明质酸（HA）及细胞胞衣样结构形成的关键酶，取进行腹腔外科手术的非尿毒症捐献者的大网膜组织,分离腹膜间皮细胞进行培养。提取细胞总RNA，以半定量RT-PCR法检测正常培养人腹膜间皮细胞（HPMCs）三种透明质酸合成酶HAS-1、HAS-2、HAS-3mRNA水平表达情况。结果表明正常培养的人腹膜间皮细胞（HPMCs）未能检测到HAS-1mRNA表达，仅能检测到HAS-2mRNA和HAS-3mRNA表达，HAS-2mRNA表达水平是HAS

11、-3mRNA表达水平的9.8倍（P0.05。继而根据上述实验结果设计特异针对HAS-2(HAS-2ecific)的反义（antisee）寡核苷酸序列，并同时设计see2序列和reverse序列作为对照，使其与Lipofectamine形成DNA-脂质体混合物，分别将其转入正常培养的HPMCs中。转染后0、8、24、48小时提取细胞总RNA，以RT-PCR法观察HAS-2mRNA表达的变化，并以微粒排除法观察细胞衣样结构面积的变化。结果表明：转染8小时后HAS-2mRNA表达下降58（P<0.05），转染24小时后HAS-2mRNA表达量明显下降89（P<0.01），转染后48小时H

12、AS-2mRNA表达已部分恢复至正常表达水平的25（P0.05。相应地，转染后24小时以微粒排除法观察HPMCs细胞胞衣样结构面积与细胞体面积的比值，亦明显减少至几乎完全消失。作为对照的see和reverse序列则没有这一作用。这一结果证实HAS-2是正常培养人腹膜间皮细胞(HPMCs)合成透明质酸以及细胞胞衣样结构形成的关键酶，并提示正常生理状态下HPMCs以合成大分子量的透明质酸为主。四炎症介质、渗透压制剂、不同分子量透明质酸对人腹膜间皮细胞透明质酸合成酶的调节作用1炎症介质对人腹膜间皮细胞透明质酸合成酶的调节作用为了解炎症因子对人腹膜间皮细胞(HPMCs)透明质酸合成酶的调节作用及对透明

13、质酸（HA）合成的影响，分离培养的第2代人腹膜间皮细胞(HPMCs)消化传代至六孔培养板,培养48小时后随机分为4组,分别为:正常对照组(对照组)、脂多糖组(L，10ng/ml)、肿瘤坏死因子-(TNF-，100u/ml)组,白介素-1(IL-1，100u/ml)组,继续培养24小时。HPMCs的HAS-2及HAS-3mRNA表达以逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法检测；细胞衣样结构合成以微粒排除法检测；细胞培养上清液透明质酸（HA）的浓度以放射免疫分析法检测。结果如下：L、TNF-组HAS-2mRNA的表达较对照组明显增加（P值均0.05，IL-1组HAS-2mRNA表达虽较对照组增强，但

14、未达统计学差异（P0.334）。L、IL-1、TNF-组HAS-3mRNA表达均较对照组明显增加（P值均0.05；L、TNF-、IL-1组对HAS-3mRNA表达增强作用分别是其对HAS-2mRNA作用的1.2倍、4.4倍、15.2倍；3组炎症因子中对HAS-3作用最强的是IL-1，其使HPMCHAS-3mRNA表达增强了21倍。对照组、L、IL-1、TNF-组细胞胞衣样结构面积与细胞体面积的比值各组间没有显著差异（P>0.05）;对照组、L、IL-1、TNF-组细胞培养上清液透明质酸（HA）的浓度均显著高于对照组(P值均<0.05)。这提示炎症因子可上调HPMCs透明质酸合成酶H

15、AS-2mRNA、HAS-3mRNA的表达和促进透明质酸的合成。由于其对HPMCs透明质酸合成酶的调节主要表现为对HAS-3mRNA的增强作用，提示炎症状态主要促进HPMCs合成小分子量透明质酸。2渗透压制剂对人腹膜间皮细胞(HPMCs)透明质酸合成的影响为了解不同渗透压制剂对人腹膜间皮细胞(HPMCs)透明质酸合成酶的调节作用及对透明质酸（HA）合成的影响，分离培养的第2代人腹膜间皮细胞(HPMCs)消化后传入6孔培养板，将细胞随机分为5组（每组6个样本）：正常对照组（对照组）；90mmol/L葡萄糖组（高糖组）；30mmol/L葡萄糖组（低糖组）；5葡聚糖组（葡聚糖）及90mmol/L甘露

16、醇组（甘露醇组）。继续培养24小时，提取总RNA,以RT-PCR法检测HAS-2mRNA和HAS-3mRNA的表达;收集细胞培养上清液，以放射免疫法检测HA浓度；以微粒排除法观察细胞基质的面积,结果如下:高糖组、低糖组、葡聚糖组、甘露醇组HAS-2mRNA的表达均较对照组明显增加(P值均<0.05);高糖组HAS-3mRNA的表达亦明显增加(P0.05）,甘露醇组HAS-3mRNA表达较对照组减弱(P0.05）。对照组、高糖组、低糖组、葡聚糖组、甘露醇组细胞培养上清液HA的浓度均显著高于对照组（P值均<0.05）;高糖组HA浓度显著高于低糖组、葡聚糖组和甘露醇组（P<0.05

17、）。因此与高浓度葡萄糖相比，葡聚糖虽增强HPMCsHAS-2mRNA表达，但对HPMCs的HAS-3mRNA无影响，提示其主要促进大分子透明质酸的合成，因而更接近HPMCs的生理状态。这一作用与渗透压可能无关。3不同分子量透明质酸（HA）对人腹膜间皮细胞（HPMCs）透明质酸合成酶的调节作用分离培养的第2代人腹膜间皮细胞(HPMCs)消化后传入6孔培养板，将细胞随机分为3组（每组6个样本）：正常对照组（对照组）；高分子量透明质酸组（分子量为1，600，000道尔顿，浓度0.01,HHA组）；低分子量透明质酸组（分子量为280，000道尔顿，浓度0.01,LHA组）。继续培养24小时后，提取总RNA,以RT-PCR法检测HAS-2mRNA和HAS-3mRNA的表达;微粒排除法观察细胞基质的面积,结果如下:LHA组HAS-2mRNA及HAS-3mRNA表达均较对照组增强（P值均0.05。HHA组HAS-2mRNA表达较对照组增强，而HAS-3mRNA表达与对照组无显著差异。LHA对HAS-3mRNA表达增