小鼠树突状细胞肉瘤不同转移能力克隆的分离筛选鉴定

1、    小鼠树突状细胞肉瘤不同转移能力克隆的 分离筛选鉴定        【摘要】目的利用小鼠树突状细胞肉瘤(DCS)细胞分离鉴定不同肺转移能力的克隆细胞株，为进一步筛选与肺转移相关cDNA片段奠定基础。方法采用极限稀释单细胞克隆法，分离出不同克隆，经体内生长转移性，体外水解酶分泌等方法进行鉴定。结果DD1、DG6肺转移分别为100%，27%，其具蛋白酶水解能力的细胞分别为15.80%和5.39%，DG6的体内生长明显较DD1缓慢。结论筛选出了高肺转移克隆DD1，低

2、肺转移克隆DG6。【关键词】树突状细胞肉瘤；肺转移；克隆；小鼠【中分类号】R730；R731-33【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)04-332 SCREENING AND IDENTIFICATION OF CLONES WITH DIFFERENTMETASTATIC ABILITY FROM DENDRITIC CELL SARCOMA CELLSLIU Yu-qinGU BeiZHAO Xue-meiLI Cun-xiGAO JinZHANG Jing-bo（Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy

3、 of Medical Sciences PekingUnion Medical College, Beijing 100005, China）【Abstract】ObjectiveFrom dendritic cell sarcoma(DCS) cells, to screen and identify lung metastatic clones for further screening of lung metastasis related cDNA. MethodsLimited dilution was used to isolate and establish single cel

4、l clones. In vivo metastasis and in vitro proteolysis were used to determine different clones. ResultsThe rate of lung metastasis of clone DD1 and DG6 were 100% and 27% respectively. The percentages of proteolytic cells of them were 15.80% and 5.39% respectively. The in vivo growth of DG6 is obvious

5、ly slower than that of DD1. ConclusionDD1 proved to be a high lung metastatic clone, while DG6 a low lung metastatic clone.【Key words】Dendritic cell sarcoma, Lung metastasis, Clone; Mouse肿瘤细胞的侵袭转移是肿瘤治疗的难题，肿瘤的转移是由异质性的母系群体中，少数具有高转移能力的细胞而形成的。肿瘤的转移还具有器官亲和性1，因此肿瘤转移是肿瘤细胞与宿主器官组织相互作用、特异选择的结果。本研究的目的就是从高转移性肿瘤

6、细胞系中分离、鉴定不同肺转移能力的克隆细胞，为进一步克隆肿瘤转移器官亲和性cDNA片段或基因奠定基础。材料和方法1.细胞来源及培养实验选用本室自建肿瘤细胞系，小鼠树突状细胞肉瘤(DCS)2，常规RPMI1640培养基加10%新生牛血清和双抗(青霉素105IUL、链霉素105IU/L)培养。2.DCS细胞单克隆细胞株的分离收集对数生长期DCS细胞，台盼蓝染色，活细胞>95%。采用连续稀释法稀释至10个细胞ml。96孔板2块，每孔加0.1ml该稀释细胞悬液，然后再加入0.1ml培养液，贴壁2h后，倒置显微镜下观察并标出单细胞孔。连续5d反复标记单细胞孔，快速生长的克隆于10d时接种6孔板，扩

7、大培养。3.DCS细胞及克隆细胞蛋白水解能力的鉴定详细方法见文献3。简言之，用小鼠血浆涂布盖片，纯酒精固定后，热气流速干，置96孔板中，培养液洗涤后备用。实验时，6孔板内每孔加3ml培养液，10万个细胞，37，5%CO2孵箱温育60min，然后洗去未粘附细胞，更换新的培养板及培养液继续培养至24h。取出盖片，0.01mol/L pH7.4的PBS洗3次，2.5%戊二醛固定15min，考马斯亮蓝R250(Serva,NY)染色30min，漂洗、风干、树胶封片，光学显微镜下观察并摄片。4.细胞蛋白水解能力结果判断经染色后血浆基质为蓝色，肿瘤细胞可将其周围的蛋白基质水解，留下透明空斑区，该透明空斑的

8、有无及大小即可反映肿瘤细胞的蛋白水解能力(1)。将瘤细胞随机计数200个以上细胞，计数水解细胞的比例。5.DCS细胞及克隆细胞体内肺转移能力的鉴定分别收集DCS母系及克隆的细胞，制备细胞悬液，以2×1060.2ml肿瘤细胞接种于近交系615小鼠右侧腋下，观察记录肿瘤生长情况。于2223d全部处死。取引流淋巴结及肺、肾、肝、脾、脑组织，10%PBS福尔马林固定，常规脱水、石蜡包埋、切片、HE染色、树胶封片，组织学观察。肺内肿瘤组织学分级参照高进4分级法。级：肺内查见15个小转移灶(直径<1 mm)。级：肺内有610个小转移灶或12个中等转移灶(直径12 mm)。级：肺内广泛分布小

9、转移灶10个以上，或有大转移灶(直径>2 mm)。整个肺叶由转移瘤灶取代。6.肿瘤组织中Laminin(LN)的免疫组织化学观察瘤组织经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋、切片。LN多抗系SIGMA公司产品(Lot 086H4822)，120稀释。免疫组织化学染色采用SP法，DAB显色。结果表1不同克隆细胞水解细胞百分比%Table 1 The percentage of proteolyticcells in different clones克隆细胞株clones123平均averageDCS-DD1DF1-DG6DF7-      &#

10、160;  1DD1和2 DG6细胞形态。相差×100Fig.1The image of DD1 and Fig.2 DG6 cells. Phase contrast×100    3DD1和4DG6 在蛋白基质上蛋白水解活性像。×100Fig.3 The proteolysis of DD1 and Fig.4 DG6 on protein-coated coverslip.×100表2各克隆细胞株体内肺转移情况Table 2 The lung metastasis of the clone

11、s克隆细胞株clones成瘤率tumorigenecity肺转移率%rate of lungmetastasis肺转移程度degree of lung metastasisDCS100(1212)83(1012)721DG6100(1212)27(312)300DF7100(1212)30(310)120DF1100(1212)58(712)610DD1100(1212)100(1212)561     从上表可以看出，高转移克隆细胞株有DD1。中转移克隆细胞株有DF1。低转移克隆细胞株有DG6、DF7。选DD1和DG6进行重复实验，其体内生长曲线如5。

12、其平均瘤重及肺转移情况与第1次实验结果基本一致，见表3。 表3DD1和DG6体内重复实验结果Table 3 The in vivo metastasis of DD1 and DG6.of repeated experiments细胞克隆株clones动物数(只)number ofanimals平均瘤重(g)average tumorweight肺转移率(%)rate of lungmetastasisDD11080DG61127     5DD1和DG6体内肿瘤生长曲线Fig.5 THe growth curve of DD1 and DG64.肿瘤组

13、织中LN免疫组织化学检查结果DCS肿瘤组织内细胞间基质中LN呈强阳性(6)。    6 DCS肿瘤组织中LN组织化学染色。 SP法 ×400Fig.6 LN immunochemical stainning of LN of DCS tumor tissue.S-P stain×400讨论人们对肿瘤转移的器官亲和性早有认识。在上世纪1889年病理学家Paget就提出了癌转移的“种子与土壤学说”。即只有具有转移能力的肿瘤细胞运行至适宜的器官微环境中，肿瘤转移才能形成，肿瘤转移是转移性癌细胞与宿主器官(组织)相互作用、特异选择的结果5。已

14、有的研究表明，肿瘤母系群体中肿瘤细胞是异质性的。我们研究组以前的工作中也先后建立了数种不同转移潜能的克隆6。深入的基因水平的研究工作表明：肿瘤细胞的生物学行为的变化都是以基因表达调控的变化为基础。迄今有关癌基因、抑癌基因的研究已取得了很大进展。人们也已开始了肿瘤侵袭基因(invasion gene)、肿瘤转移基因及转移抑制基因的研究7。对肿瘤转移器官特异性相关基因的寻找是一个新的研究领域。本研究就是要筛选出不同肺转移能力的癌细胞亚群，为进一步差异筛选癌细胞转移器官亲和性相关DNA片段或基因奠定基础。本研究中用单细胞克隆法得到的DD1和DG6两个亚系，体外经水解酶测定，两者差异明显。体内经生长和

15、肺转移能力测定，相差也很明显。证明两者确实为具有不同肺转移能力的亚系，是进一步筛选肿瘤肺转移相关DNA片段或基因的有力工具。DCS细胞体内移植成瘤后，瘤组织及周围解剖时见大量粘稠物质。为明确其性质，进行了免疫组织化学检查。本研究LN染色(S-P法)呈强阳性，信号位于瘤细胞间，组成肿瘤间质。本文14，6见插第10页【基金项目】卫生部基金资助项目(98-1-006)【作者简介】刘玉琴(1964)，女(汉族)，山东省人，副研究员，硕士导师刘玉琴（中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所，北京100005）顾蓓（中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所，北京100005）赵雪梅（中国医学科学院

16、中国协和医科大学基础医学研究所，北京100005）李存玺（中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所，北京100005）高进（中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所，北京100005）章静波（中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所，北京100005）参考文献1Nicolson GL. Organ specificity of tumor metastasis, role of preferential adhesion and growth of malignant cells at specific secondary siteJ. Cancer and metastasis review, 1988,7:143-167.2李存玺，顾蓓，高进.小鼠树突状细胞系的建立及形态学鉴定J.解剖学报，1997，28(1)：6368.3刘玉琴.侵袭和转移性肿瘤细胞相关生物学特性研究方法和应用.见高进主编癌的侵袭与转移基础研究与临床M.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1996：1527.4高进.癌细胞转移模型的建立及