PCR微流控芯片

1、PCR微流控芯片一. PCR技术简介聚合酶链反应(PCR polymerase chain reaction技术是一种完美的体外无限扩增核酸的技术。首先将DNA模板、引物(primer、Taq酶、缓冲液、dNTP(A、T、C、G四种碱基等混合均匀,加热至一定温度(94使模板失去活性,双链解离,形成单链DNA,这个过程称之为DNA的变性(melting or denaturation;然后降温至一定温度(55,使引物和DNA模板复性,两者发生特异性结合,此阶段称之为退火(annealing;最后再加热到一定的温度(72,使Taq酶活性达到最大,在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复

2、制的起点,合成新链,此过程称之为延伸(extension。 这三个阶段可概括为:高温变性低温退火中温延伸。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍。将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。扩增产物量由公式Y=A(1+Rn决定。其中A为模板拷贝数,R为扩增效率,n为循环次数,一般循环次数为2045次。二.PCR微流控芯片(PCR microfluidics第一代PCR是PE-Cetus公司的热循环仪。第二代是静态的微反应槽PCR

3、芯片(micro chamber PCR chip。第三代PCR技术是PCR微流控芯片。下面我们从反应体积大小,循环时间的长短等几个方面对这三类PCR技术做个比较。 通过表1的对比,我们可以看出PCR微流控芯片较前两种技术的优势是:在保证一定扩增效率的前提下,反应体积可变,样品的输入和输出是连续的,反应从静态变为动态;反应时间缩短。PCR微流控装置主要可分为反应池内固定扩增式PCR(Chamber stationary PCR microfluidics,连续流动式PCR(Continuous-flow PCR microfluidics和热对流驱动PCR(Thermal convection

4、-driven PCR microfluidics三种形式。是传统PCR扩增的微型化,其反应速度仍然受PCR反应体系的热容、反应池衬底材料的热容、加热器以及传感器的热容等因素制约,因此需要对PCR系统的热容优化以便缩短反应时间和减少能量消耗。 一种反应池内固定扩增式PCR示意图DNA样品和反应试剂连续流动经过三个不同的恒温带,从而达到DNA片段热循环扩增的目的,该方法由于不需要反复地加热或冷却PCR装置,加热-冷却速度一般不受PCR装置系统的热容所限制,反应速度较快。 一种连续流动式PCR示意图3. 热对流驱动PCR是基于Rayleigh-Be´nard 对流原理。这种装置不需要借助

5、外 热对流驱动PCR 力只需要浮力就能驱动PCR 试剂流经不同的温度区,跟前两种相比,这种芯片制造简单,价格低廉,而且具有更快的温度传导速度,更易于集成。 一种热对流驱动PCR 示意图三. 连续流PCR 微流控芯片连续流PCR 微流控芯片有许多的设计形式: 振荡式(oscillatory devices,闭环式剂在微通道内不停的往复运动,穿梭于不同的温度加热区,所以循环数以(closed-loop devices和固定循环数式(fixed-loop devices。1. 振荡式PCR 试是可调节的。下图中,在注射泵的作用下,试剂先经过退火区和延伸区进入变性区,完成DNA 变性后穿过延伸区进入退

6、火区完成引物退火。最后再进入延伸区延伸,至此完成一个循环。在不同温度区的停留时间可以通过注射泵调节,也可以通过微通道的结构进行设计。 一种振荡式PCR装置示意图 一种闭环PCR装置俯视和剖面图上图中,PCR样品经过三个不同的通道,然后再外接泵的作用下由出口重新返回入口进行循环。三段微通道对应三个不同的温度区。中间的空气层阻隔了不同温度区间的温度传导。与振荡式PCR不同的是,循环式流动方向一直是不变的。由此可见,闭环PCR循环数也是可以调节的。3. 固定循环数式PCRPCR 的循环次数是固定的,但这种方式的控制比较简单。 顾名思义,就是一种固定循环式PCR 装置示意图上图是一种辐射状的固定循环式

7、的PCR 置。这种装置一共可以完成34个循环。四. 微液滴PCR 技术(PCR in droplets增的方式是单相的PCR ,单相PCR 有很的面积/体积比很大,通道内壁会对试剂和样品有吸收,所以会造横截面的速度分布为抛物线形状,中间速度最大而装A 为油的入口,B1和B2是两个试剂水溶液入口,这两部分构成了一个“T ”形连接C ,从而形成了液滴(droplet,第四部分提到。液滴经过D 区完成变性,然后到外围实现退火和延伸。当液滴再返回中间的D 区完成DNA 变性后,一个新的循环又开始了。在完成34个循环以后,在F 处离开。将PCR 样品直接混合送入微通道进行扩多的缺点:1.由于微通道内成连

8、续进样间的运送污染。2在压力驱动条件下,微通道壁面速度为零,所以在横截面不同位置的PCR 样品将经历不同的反应时间。3.扩增具有选择性，更易于放大短的基因片段，会产生很多副产物。 液滴 PCR（PCR in droplets）技术解决了单相 PCR 的上述问题。 液滴 PCR 技术示意图 在上图中，PCR 混合物被包含在离散的液滴中，经过微通道中的不同温度 区。液滴 PCR 技术与单相 PCR 技术相比还有许多的优势，如消除了连续样品间 的运送污染、通道内壁的吸收和样品的扩散稀释，防止片段较短的、意想不到的 副产物合成，快速的热响应，很少的试剂消耗等。另外，不同的液滴还可以携带 不同的 PCR

9、 样品，尤其适合于单细胞和单分子放大。 一种液滴产生的方式示意图 液滴产生方式如上图所示，PCR 混合液从中间喷嘴注入，携带液体油从 旁边的喷嘴注入，由于水和油和不相溶性，所以在油中形成了水液滴。 虽然微液滴 PCR 技术才刚刚出现，但近年来的研究表明了这种技术的巨大 潜力。 五微阀，微泵和微混合器与 PCR 微流控芯片的关系 1. 微阀与PCR微流控芯片 微阀在PCR微流控芯片中的功能包括：流动调节，开/关切换及PCR样品 的密封等。微阀对于PCR扩增与其他的DNA分析过程的结合至关重要。 2. 微泵与PCR微流控芯片 微泵一方面要使PCR样品和试剂从入口进入反应腔/通道，并把PCR产物 排出反应腔/通道以便于进一步的检测。另一方面，在连续流动流PCR微流控 芯片(continuous-flow PCR chips中， 微泵还要驱动PCR样品流经两个或三个不 同的温度区。另外，微阀和微泵的结合还可以