改良的HPLC法测定大鼠和家兔全血中的环孢菌素A

1、    改良的HPLC法测定大鼠和家兔全血中的环孢菌素A        提要为了改善基线，提高分离度和精密度，对文献报道测定环孢菌素的HPLC法在血样处理、色谱柱和流动相等方面作了改进。酸碱萃取以水平振荡代替涡旋混合，使样品的酸萃取和碱洗涤完全；洗涤重组样用的正己烷改用色谱纯，洗涤分两次进行，以彻底消除干扰；将150mm×4.6mm(10m)柱改为250mm×4.6mm(5m)柱，并将流动相中乙腈-甲醇-注射用水的比例由613改为733，以提高柱效而又不延

2、长测定时间；严格控制柱温和流动相纯度使基线平稳。改进后，环孢菌素A和D的基线完全分离，回收率变异由9.0%减小到6.3%以下。并用该法测定了大鼠和家兔的血药浓度。关键词环孢菌素A高效液相色谱法纳米球胶体纳米囊胶体IMPROVED HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHIC DETERMINATION OF CYCLOSPORINE A IN WHOLE BLOOD SAMPLES OF RAT AND RABBITLi HongshanYe GuoqingZhao JinglingWei Shuli(Pharmaceutical Department, Be

3、ijing Medical UniversityBeijing 100083)ABSTRACTAn RP-HPLC method for determining Cyclosporine A(CyA) in whole blood reported by Wu Laiwen was modified in extraction, column, and mobile phase to get a baseline separation, a improved resolution rate, and a smaller RSD of recovery. The acid-base extrac

4、tions were done by horrizontally shaking instead of vortex mixing; The purification of reconstructed samples was washed by UV grade n-hexane instead of AR grade;The column was 250 mm×4.6 mm(5 m) instead of 150 mm×4.6 mm(10 m);And the mobile phase was acetonitrile(UV)-methanol(UV)-water(inj

5、ectable) with a ratio of 733 instead of 613.In this way, we got a complete base separaton CyA with the internal standard, and decreased RSD of recovery from 9.0% to below 6.3%.CyA whole blood samples of rats and rabbits were determined by the modified method.Key WordsCyclosporine AHPLCNanospheres co

6、lloidNanocapsules colloid环孢菌素A(Cyclosporine A,CyA)被广泛应用于肾、肝、心、肺、胰、小肠、骨髓和皮肤等组织器官移植后的抗排斥治疗。影响CyA血药浓度的因素很多，其临床毒副反应与剂量相关1，故需对血药浓度进行监测。在放射免疫、荧光偏振免疫和HPLC等监测方法中，HPLC法的选择性较好24，但步骤繁琐、仪器昂贵、干扰严重。现结合制剂评价，对方法9进行了改进。1实验部分1.1.仪器与试剂美国TSP公司Spectra System P1000高效液相色谱仪及Spectra 100可变波长紫外检测器；中科院大连物化所WDL-95色谱工作站(AST486微机

7、上进行数据采集和谱积分)；三环牌YKH-型液体快速混合器(江西医疗器械厂)。甲醇(天津西华特种试剂厂)、叔丁基甲醚(解放军57615部队)、乙腈、正己烷(天津四友公司)均为色谱纯；内标液为50g/ml的环孢菌素D(CyD)甲醇溶液。1.2色谱条件美国Phenomenex silica RP-18色谱柱(250mm×4.6mm，5m)。流动相为乙腈-甲醇-注射用水(703030)；流速为1.5ml/min；检测波长210nm；柱温70；AUFS为0.005。1.3实验方法1.3.1血样处理和进样取CyA血样0.5ml于10ml具塞离心管，加内标液20l和稀盐酸(180mmol/L)1m

8、l，在液体快速混合器上快速涡旋混合30s；加叔丁基甲醚5ml，密塞；水平固定于康氏振荡器上，振荡15min，4000r/min离心10min。取紫色醚层置5ml具塞离心管，加稀氢氧化钠溶液(95mmol/L)1ml，密塞；水平固定于康氏振荡器上，振荡5min，4000r/min离心10min。取无色醚层置5ml具塞离心管中，在40水浴中以N2吹干。残渣加120重组液(乙腈-水70ml30ml)，涡旋混合2min；加正己烷1ml，涡旋混合2min，4000r/min离心5min，弃己烷层；残液再如此操作，取最终残液40l注入色谱仪。1.3.2标准曲线的制备精称200mg CyA，以乙腈制备2mg

9、/ml的CyA贮备液。以甲醇稀释贮备液，制成5、10、20、40、50、60、80、100g/ml等系列浓度；取稀释液10l，加入盛空白血0.5ml的具塞离心管中，制成含CyA分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1、1.2、1.6、2g/ml的系列标准血样，分别按前述方法处理和进样。采集色谱数据并进行谱积分，以CyA与CyD的峰面积比值(A/Ai)对标准血样浓度作线性回归。1.3.3萃取回收率取CyA贮备液，以重组液稀释成0.1、1、2g/ml三种浓度，作为对照样，取40l注入色谱仪，积分求峰面积。按标准曲线方法配制0.1、1、2g/ml的血样，分别按前述方法处理(不加内标)，作为萃取样，取

10、40l注入色谱仪，积分求峰面积。各浓度的萃取样峰面积与相应浓度的对照样峰面积比值即为该浓度血样的萃取回收率。同法求2g/ml内标的萃取回收率。1.3.4方法回收率同萃取回收率方法配制三种浓度的血样，按“血样处理和进样”操作，求A/Ai，代入标准曲线方程求CyA的量，此量与相应加入量之比即为方法回收率。1.3.5日内和日间精密度同一天内，上述三个浓度各测5次方法回收率，各浓度的RSD即为日内精密度。于不同5d，三个浓度各测5次方法回收率，各浓度的RSD即为日间精密度。1.3.6灵敏度配制不同低浓度的CyA血样，处理，测定讯噪比为2时的最低检测量和最低检测浓度。1.3.7家兔注射CyA纳米球和纳米

11、囊胶体的血药浓度测定取2.53kg的健康雄性白兔9只，随机分为3组，就环孢菌素A商品注射剂Sandimmun Sandoz(San)，自制纳米球胶体(NSC)和自制纳米囊胶体(NCC)等三种制剂进行3个周期的药动实验，洗净期为7d。耳缘静脉注射，剂量为4mg/kg。于给药后不同时间取全血0.5ml，按前述方法处理和进样，记录谱并积分，以标准曲线计算全血药物浓度。1.3.8大鼠口服CyA纳米球和纳米囊胶体的血药浓度测定取200250g的健康雄性大鼠24只，随机分为3组，分别口服环孢菌素A商品注射剂Sandimmun neoral(Neo)，自制纳米球胶体(NSC)和自制纳米囊胶体(NCC)等3种

12、制剂，剂量为10mg/kg。于给药后不同时间取全血0.5ml，按前述方法处理和进样，记录谱并积分，以标准曲线计算全血药物浓度。2实验结果2.1空白血样及含CyA和CyD血样的HPLC谱空白血样及含CyA和CyD的血样的HPLC谱(1)表明，家兔和大鼠血液中的内源性物质不干扰CyA的测定，CyA与CyD基线分离，分离度大于1.5。Fig 1Representative chromatograms obtained in the analysis of 0.5mlA blank blood of a ratBa rat blood sample containing CyA and CyDCbla

13、nk blood of a rabbitDa rabbit blood sample containing CyA and CyD2.2标准曲线和方法学结果大鼠和家兔血样的标准曲线及相关系数为A/Ai=0.412c-0.00602r=0.9999；A/Ai=0.405c+0.000413r=0.9992(标准曲线中c的浓度为g/ml)。方法学结果见表1。结果表明，标准曲线浓度范围宽，线性好。CyA和CyD的萃取回收率均在70%以上，且相差不过10%。方法回收率为96%104%，日内和日间变异较小。该法的最低检测量均为10 ng，最低检测浓度为20 ng/ml。Table 1The method

14、ological indices of the HPLC for mea-suring CyA in blood of rat and rabbit(%，n=5)BloodAdded(g/ml)ER(RSD)MR(%，n=10)Within dayprecisionDay to dayprecisionRat0.178.61(6.3)99.76.293.13178.92(5.8)96.93.073.64288.97(4.9)100.22.565.812(CyD)82.99(4.4)Rabbit0.180.79(5.9)100.33.794.18184.00(5.6)99.22.226.0428

15、6.07(4.1)99.51.795.652(CyD)78.57(5.6)ERextracted recovery;MR=method recovery2.3三种制剂的血药浓度数据三种制剂给家兔静脉注射和大鼠口服的血药浓度数据见表2。Table 2The CyA concentration in whole blood samples versus time data of the preparations after po administration to rat or iv to rabbitc(g/ml)Samples of rat bloodc(g/ml)Samples of rab

16、bit bloodtime(h)time(h)0.1670.514812240.511.523524314872Neo1.792.472.602.291.711.350.410.2320.150.03San2.551.811.120.770.450.290.14NSC1.791.691.901.941.541.220.520.320.180.06NSC2.121.740.980.680.400.230.10NCC1.421.571.851.701.561.310.320.230.160.06NCC2.131.791.310.790.450.270.133讨论 3.1因CyA与血液各组分具有很高

17、的结合率，且结合随温度而变化，故需测定全血中的药物浓度。放射免疫法测定CyA血药浓度缺乏特异性2，荧光偏振免疫法的线性范围受转氨酶和肌酐值的限制3。唯HPLC法专属性强，线性范围宽。液-液萃取HPLC法需对血样依次进行酸化、醚萃取、碱和正己烷洗涤等处理，才能消除内源性杂质的干扰。国内报道的单步萃取法10无酸碱处理和梯度洗脱过程，未能重现。以上实验采用的萃取法重现性较好8，方法学研究表明，其不仅适于人血样，也适于家兔和大鼠血样的CyA测定。3.2实验改进之处在于酸化后的醚提取和碱洗涤均将密封性好的样品管水平固定于康氏振荡品上，120 r/min振荡使萃取和洗涤充分；从而避免了涡旋混合造成的萃取率

18、的差异和洗涤的不完全，不仅提高了精密度，而且有利于改善基线。酸萃取振荡时间最好控制在1315min；将洗涤用正己烷由分析纯改为色谱纯，且洗涤分两次进行，以彻底除去脂溶性杂质，使CyA与内标均达到很好的基线分离；将150mm×4.6mm，10m柱改为250mm×4.6mm，5m柱，并将流动相中乙腈-甲醇-注射用水的比例由613改为733，从而提高了柱效和分离度(通过与文献比较谱可以定性地看出)而又保证样品在10min内测定完毕。3.3在1080范围内，CyA柱效的对数与温度有线性关系，故HPLC法测CyA均需升高柱温。测生物样品时，柱温应在65以上。实验发现，柱温波动时，引起

19、基线的大幅度起伏，且分析纯甲醇配制的流动相较色谱纯甲醇配制的起伏大，可能是温度影响了流动相及其杂质成分的比吸收。因此，应使用控温性能好的柱温箱，并采用尽可能纯的溶剂配制流动相。作者单位:北京医科大学药学院北京 100083参考文献1Shaw LM.Advanced in cyclosporine pharmacology, Measurement, and therapeutic monitoring. Clinic Chem, 1989,35(7)12992Lensmeyer GL, Fields BL. Improved liquid-chroma-tographic determinat

20、ion of cyclosporine, with concomitant detection of a cell-bound metabolite. Clinic Chem,1985,31(2)1963Blick KE, Melouk SH, Fry HD,et al.A validation study of selected methods routinely used for measurement of cyclosporine. Clinic Chem, 1990,36(4)6704Carruthers SG, Freeman DJ, Koegler JC,et al. Simplified liquid-chromatographic analysis for cyclos-porine A, and comparison with radioimmunoassay. Clinic Chem,1983,29(1)1805Kabra PM, Wall JH, Dimson P. Automated solid-phase extraction an