瘦素对于孤雌激活PA和转基因体细胞细胞核转移SCNT导出的猪

1、瘦素对于孤雌激活PA和体细胞细胞核转移SCNT导出的猪胚胎发育各阶段的辅助促进作用Heng-xi WEI,Kun ZHANG,Yu-fang MA,Yan LI,Qiu-yan LI,Yun-ping DAI and Ning LI摘要：数据表明，瘦素在胚胎植入前的胚胎发育过程中扮演重要角色，但仍然存在着争议并且很少人了解瘦素是否有一个对于猪胚胎发育个阶段的辅助控制作用。实验的目标是为了调查在体外培养中加入瘦素中间物对于由PA和SCNT导出的猪胚胎发育的影响。我们发现加入50ng/ml重组瘦素提高了PA胚胎达到囊胚阶段的速度并且和对照组相比增加了囊胚阶段所有细胞的数目。在瘦素加至50ng/ml

2、 时SCNT胚胎达到囊胚的最大速度，同时囊胚细胞数目在瘦素达到500ng/ml有可观的增长速度。然而，在任意实验组中，内细胞团数目占到所有细胞的比率不受瘦素作用。从第三天开始补充50ng/ml瘦素，大概在第48个细胞发育阶段，与不控制相比，孤雌激活胚胎发育成囊胚的速度明显的增加并且抑制细胞凋亡。当在第一天到第三天或第四天到第六天加入瘦素（50ng/ml）到培养基，对于胚胎发育没有有效的作用。这些结果表明瘦素能够促进发育和提高孤雌激活胚胎和细胞核转移的胚胎的质量；同时50ng/ml瘦素能够完成对处于48细胞阶段胚胎的基本刺激作用，瘦素对于猪的孤雌激活和细胞核转移的胚胎的受精卵转变没有作用。关键词

3、：胚胎发育，瘦素，孤雌激活，猪，体细胞核转移瘦素对于猪无精生殖和克隆胚胎的作用体细胞核转移克隆的猪和其他多种哺乳动物的生产不仅有力地表明分化的体细胞仍然保持完整的基因信息，因此能够再分化和去分化，而且同时提供了一种研究胚胎干细胞、转基因、基因打靶和这些物种的人造可复制技术的革命性的方法。虽然体细胞核转移在农业，医药和基础研究中有重要意义，但由于低效率，广泛应用的体细胞核转移技术被限制。但相信它的低效率是重新编码的时错误所造成，特别是未完成的后来的重新编码，能通过供应准备、卵母细胞成熟，激活和胚胎培养体系的修改，使其某几个区段。研究表明改变氧含量、基本培养基或补充某几种生长因子，细胞因子，维他命

4、或者氨基酸能够增强胚胎植入前的发育或者克隆胚胎的质量。瘦素，一种16KD可复制激素由肥胖基因产生，在许多的器官包括可再生部位合成，对于繁殖有一个显著直接的作用。研究证明瘦素有益于牛和猪的卵母细胞体外成熟通过STAT3和MAPK途径，据此许多的研究小组已经试图去测试是否瘦素的补充可以提高早期哺乳动物胚胎的发育。1000ng/ml浓度的瘦素能够显著的增加猪体细胞核转移胚胎的囊胚化速度，但这种作用没有在猪的体外胚胎培养中发挥。然而，瘦素10ng/ml浓度能够显著地增加猪的孤雌激活胚胎卵裂和生成囊胚的速度。老鼠胚胎中，Kawamura已经证明瘦素能够显著地促进老鼠扩张囊胚和孵化囊胚的发育，同时Swai

5、n证明瘦素浓度的增加对于单细胞胚胎发育没有作用；Fedorcsak和Storeng已经证明甚至低浓度的瘦素能够减少DNA碎片和抑制胚胎发育至囊胚阶段。基于以上的研究报告，我们已经了解瘦素对于猪和老鼠胚胎早期发育的作用仍然存在着争议。因此进一步的研究被要求确定查明瘦素的作用，特别是瘦素对于猪胚胎体外培养发育的作用是否是一种分阶段的辅助调控类型。现在的研究我们旨在调查瘦素剂量不同，使得其对于从SCNT和PA导出的体外培养的猪胚胎发育和质量的影响，探索瘦素对于猪胚胎体外培养发育的作用是否是一种分阶段的辅助调控类型。材料和方法化学药品除了其他申明，所有的化学药品从Sigma-Aldrich购买。卵母细

6、胞的收集和体外培养在屠宰室收集发情母猪卵巢，放于添加抗生素的3035生理盐水在3hour内运送到实验室。从36mm直径的卵泡发育而来的卵丘卵母细胞复合体COCs被连在10ml自由使用注射器的18规格细针吸取。将至少有三层细胞堆积的COCs筛选，在补充10%猪卵泡液、0.57mM半胱氨酸、0.1mM的EDTA-Na、2mM的Na-丙酮酸盐、1mM的L-谷氨酸盐、10ng/ml表皮生长因子、10IU/ml孕马血清促性腺激素和10IU/ml人绒毛膜促性腺激素的组织培养液中培养。pFF被从5-8mm直径的卵泡中吸出，在1600r/min转速下转30min，收集上层清液，通过0.45um注射过滤器过滤并

7、储存至-20直到使用。所有的体外成熟培养的培养基在体外成熟培养前必须在CO2细菌培养器中缓冲2h。50-60的COCs在450um的底部覆盖着400ul矿物油的培养基中在39和100%湿度，空气含5%CO2培养42-44h。猪转基因供细胞的准备无菌条件下获取日龄30d的长白猪的胚。在去掉胎的头部和内脏后，体组织在DPBS中冲洗两次，且切成小片。小片被植入T-75细胞培养烧瓶中，在补充了20%FBS、1%非必需氨基酸、青霉素和链霉素温度39，含5%CO2潮湿空气环境下的DMEM中培养3-6天至纤维原细胞单层在组织移植体周围形成。移植组织移走同时生长聚集的纤维原细胞再次培养。在第二阶段，纤维原细胞

8、用脂质体转染线性质粒pCE-EGFP-IRES-NEO。在用600-800ug/ml的G418筛选14天后，表达GFE的细胞在倒入液氮前再次被传代或保存在含30%FBS、10%DMSO的DMEM中。在进行体细胞核转移前，细胞被融解，随后培养3-5天直到细胞聚集。体细胞核转移的显微操纵去核卵母细胞在逐滴赫佩斯缓冲液缓冲过补充了5.0um/mlCB含盖矿物油的NCSU-23培养基中用装备了操作系统的TE2000U反向显微镜观察得到。融合，激活和胚胎培养重组双链在融合媒介0.25M甘露醇，0.1mM的CaCl2，0.1mM的MgCl2冲洗和平衡2-3min，然后在充满融解介质的密闭室中通电在两个DC

9、脉冲同时融解和激活。在用含10ug/mlCB和10ug/mlCHX的PZM3液滴培养4h后，重组双链融解的结果在立方显微镜中检测出来，同时融合的胚胎随后被转移到PZM3介质并被在39含5%CO2、5%O2和90%N2、100%湿度条件下体外培养7d。15-20组的胚胎在100ul液滴中培养且30-50组的胚胎在400ulPZM3介质培养。孤雌激活被和体细胞核转移一样的没有CHX和CB的激活参数控制着。体外培养的卵裂和囊胚比率在第二天和第六天被客观的记录。细胞计数和特异性染色囊胚细胞数目在其被用10ug/ml赫斯特33342染色10-15分钟后能够在荧光显微镜下被计数。囊胚质量通过内细胞团和外胚

10、层细胞特异性染色而被进行评估。明显地，囊胚清晰带被5%链霉蛋白酶溶液移动1min，然后囊胚被在补充了1mg/mlPVA的PDBS中冲洗了三次，每次5min。囊胚自由条带以1:5的比例被暴露到生物素化兔抗猪血清液稀释50-60min，然后被冲洗以1:10比例转移的豚鼠血清补充物稀释50-60min，包含有10um/ml碘化丙碇和10ug/ml的bisbenzimide。在DPBS中冲洗至少5次后，被染色的囊胚在UV光下，在幻灯片上用荧光显微镜被计数和观察。细胞凋亡实验孤雌激活囊胚第六天在补充有0.1%聚乙烯吡咯烷酮PBS被冲洗三次，且和多聚甲醛溶液在室温下混合1-2h。在钠柠康酸溶液中，室温下用

11、0.5%氚核X-100透过细胞膜30min。混合的囊胚在TUNEL反应混合物黑暗中中培养1h。在停止反应后，胚胎细胞断裂的DNA末端用TDT和荧光-dUTP标记。胚胎然后被冲洗且用10ug/ml赫斯特33342在室温下黑暗中染色15min。将它们冲洗三次装上幻灯片。在TUNEL前室温无RNA酶和DNA酶黑暗环境中培养1h后的混合胚胎起积极控制。实验设计实验1，研究瘦素浓度对于瘦素在孤雌激活胚胎生长发育和质量的作用。孤雌激活之后，胚胎在补充了0,5,10,50,100,500ng/ml浓度瘦素的PZM3中被随机分配和培养从第一天至第六天，为了计算胚胎植入前的发育水平。实验2，SCNT胚胎胚胎在补

12、充了0,5,500ng/ml浓度瘦素的PZM3中被随机分配和培养从第一天至第六天。浓度按照实验一被选择。实验3，瘦素补充物在孤雌激活胚胎不同发育阶段的作用被计算而得。浓度根据实验1和2来选择。实验设计成五组：对照组，在没有添加瘦素的体外培养介质中培养第一天到第六天；D1-D3组，瘦素只被第一天到第三天添加进去，为了计算瘦素是否对于胚胎MZT有益作用；D3-D6组，瘦素被从第三天和第六天开始添加；D4-D6组，瘦素被从第四天和第六天开始添加；且D0-D6组，研究组，瘦素被从第一天到第六天添加到体外培养基。实验4，瘦素补充物在SCNT胚胎不同发育阶段的作用被计算而得。设计和实验3如同。实验5，不同

13、瘦素处理组的孤雌激活胚囊被TUNEL实验决定。实验结果在体外培养介质中不同剂量瘦素对于猪孤雌激活胚胎发育和质量的影响如表1所示，孤雌激活胚胎的卵裂比率500ng/ml组比10和100ng/ml组显著地减少。50ng/ml组的囊胚比率比5和500ng/ml组的要高，500ng/ml组比10,50和100ng/ml组要低。50ng/ml组囊胚细胞数目比空白组要低，内细胞团细胞数目比空白组要高，但内细胞团占所有细胞比率在所有六个组中没有显著地不同。在体外培养介质中不同剂量瘦素对于猪SCNT胚胎发育和质量的影响如表2所示，50ngml和控制组比较起来，囊胚比率显著增加，但四组的卵裂率没有不同。瘦素剂量

14、的增加使得囊胚细胞总数趋向增加，在500ng/ml达到显著，但ICM和TE细胞数目和ICM内细胞比率在组之间没有不同。50ng/ml剂量瘦素对于猪孤雌激活胚胎发育和质量的影响如表3所示，卵裂比率和囊胚细胞数目比空白组增加，但是增加不明显。与空白组和D1-D3组相比囊胚比率在D3-D6组和D0-D6组增加，这就意味着瘦素可能在孤雌激活胚胎第4-8阶段起着基本刺激作用且瘦素对于孤雌激活胚胎的MZT没有有益作用。50ng/ml剂量瘦素对于猪SCNT胚胎发育和质量的影响如表4所示，D3-D6组和D0-D6组囊胚比率比空白组和D4-D6组要高。50ng/ml剂量瘦素对于孤雌激活囊胚细胞凋亡的作用如表5和

15、图4所示，D0-D6组与空白组比较有一个更低的囊胚细胞凋亡指标和更高的囊胚细胞数目，表明体外培养基的瘦素补充物能够限制细胞凋亡并提高猪胚胎增殖扩散速度。讨论此次研究，我们证明瘦素有一个浓度和阶段辅助调控功能，能增加达到囊胚阶段胚胎细胞的比例，提高被从PA和SCNT转出的猪胚胎的质量。更多地，我们发现瘦素限制孤雌激活胚胎的细胞凋亡。一般性地，我们相信数目较大的囊胚细胞有利于胚胎的存活，囊胚中内细胞团的比率对于着床发育和后代存活至关重要。为了增加体外培养的胚胎的质量，生长因子、细胞因子、维他命和氨基酸到体外培养基的合适增加量已经有一个研究。瘦素，一种16KD可复制荷尔蒙，已经被证明对于卵母细胞体外

16、成熟是有益的。最近，很多研究报告都证明瘦素对于胚胎体外发育有作用；但这同时仍存在着一些争议。在此次研究中，我们已经证明合适浓度添加到体外培养基的瘦素能够增加囊胚细胞比率和孤雌激活胚胎和SCNT胚胎中的细胞数目同时不影响内细胞对于所有细胞的比率，也证明瘦素能提升胚胎质量。进一步地，此次研究表明瘦素补充物对于猪PA和SCNT胚胎发育有一个阶段辅助调控功能：瘦素瘦素可能在胚胎第4-8阶段起着基本刺激作用。瘦素的调控功能可能与瘦素受体表达有关。瘦素手提据信在老鼠、猫和人类卵母细胞中有表达。现在，瘦素受体表达在猪和老鼠胚胎移植前胚胎的不同阶段都被观察到。Craig报告在猪胚胎检测到Ob-RmRNA从4-cell阶段到囊胚阶段。老鼠胚胎中，Kawamura已经证明瘦素能够显著地促进老鼠扩张囊胚和孵化囊胚的发育，同时Swain证明瘦素浓度的增加对于单细胞胚胎发育没有作用；Fedorcsak和Storeng已经证明甚至低浓度的瘦素能够减少DNA碎片和抑制胚胎发育至囊胚阶段。因此体外培养的瘦素补充有助于胚胎发育，我们的结果证实了这个。已经报道，瘦素在IVM介质中的存在加快了牛科胚胎发育且减少了囊胚细胞凋亡。现在研究显示在IVC介质中合适的瘦素剂量会导致囊胚细胞数目变多和细胞凋亡率降低。对于猪，基因