a-淀粉酶的生产工艺

1、宜宾职业技术学院论文-淀粉酶的生产工艺系部生物与化工工程系专业名称酿酒技术班级酿 酒 11103姓名王梦韵李艳梅严红俊学号201117315 201117404 201117346指导教师兰小 艳二一二年十月二十九日- 淀粉酶的生产工艺摘要-淀粉酶广泛分布于动物、 植物和微生物中， 能水解淀粉产生糊精、 麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。目前，-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发 酵以及纺织等许多行业。本次设计的淀粉酶发酵， 分别以玉米粉为碳源， 以豆饼为氮源，以 BF-7658枯草芽孢杆菌为生产菌种 , 同时做出了生产工艺流程图

2、， 详细的介绍了-淀粉酶的生产工艺。关键词： -淀粉酶；生产工艺设计；深层发酵法Alpha amylase production technologyAbstractAlpha amylase widely distributed in animals, plants and microbes, can be hydrolyzed starch produce dextrin, maltose, oligosaccharide and glucose and so on, it is the industrial production in the most widely used one o

3、f enzyme preparation. At present, the alpha amylase has been widely used in modified starch and starch sugar, baking industry, brewing, alcohol industry, hair leaven and textile and many other industries. The design of amylase fermentation, respectively with corn flour for carbon source, nitrogen so

4、urce for bean cake, with BF - 7658 bacillus subtilis strains for the production, at the same time, make the production process flow diagram, detailed introduces the alpha amylase production technology.Keywords: Alpha amylase, Production process design; Deep fermentation目录前言11 -淀粉酶的生产方法11.1 生产方法的选择11

5、. 2 - 淀 粉 酶 培 养 基 的 制 作31.2.1耐高温 -淀粉酶的生产方法41.2.2耐高温 淀粉酶的生产原料41.2.3耐高温 淀粉酶培养基制作51.2.4 耐高温 淀粉酶的另一种生产方法51.2.5 用菌种枯草芽孢杆菌来提取耐高温淀粉酶52 - 淀 粉 酶 的 菌 种 选 育62. 1菌 株 与 培 养 方 法62. 1. 1培 养 基72. 1. 2 仪 器 设 备72. 2实 验 方 法72. 2. 1细 菌 的 分 离 与 初 步 鉴 定72. 2. 2紫 外 线 诱 变 育 种72. 3诱 变 方 法 以 及 变 异 菌 株 的 筛 选73 - 淀 粉 酶 分 离 纯 化

6、83. 1 - 淀 粉 酶 的 分 离83. 2 实验方法93.2.1分析和测试方法104 讨论105 结论10前言根据淀粉酶对淀粉的水解方式不同， 可将其分为 - 淀粉酶、 - 淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶等。其中， -淀粉酶（ -1，4-葡聚糖 -4-葡聚糖苷酶 )多是胞外酶，其作用于淀粉时可从分子内部随机地切开淀粉链的 -1，4糖苷键，而生成糊精和还原糖，产物的末端残基碳原子构型为 -构型，故称 -淀粉酶。-淀粉酶来源广泛，主要存在发芽谷物的糊粉细胞中，当然，从微生物到高等动、植物均可分离到， 是一种重要的淀粉水解酶， 也是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。 它可以由微生物发酵制备，

7、 也可以从动植物中提取。 不同来源的 -淀粉酶的性质有一定的区别，工业中主要应用的是真菌和细菌淀粉酶。目前， -淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业，是一种重要工业用酶。如在淀粉加工业中，微生物 -淀粉酶已成功取代了化学降解法；在酒精工业中能显著提高出酒率。其应用于各种工业中对缩短生产周期，提高产品得率和原料的利用率，提高产品质量和节约粮食资源，都有着极其重要的作用。相对地，关于 -淀粉酶抑制剂国内外也有很多研究报道。 -淀粉酶抑制剂是糖苷水解酶的一种。 它能有效地抑制肠道内唾液及胰淀粉酶的活性， 阻碍食物中碳水化合物的水解和消化， 降低人体

8、糖份吸收、 降低血糖和血脂的含量， 减少脂肪合成，减轻体重。有报道表明， -淀粉酶可以帮助改善糖尿病患者的耐糖量。这一领域研究自 2O世纪 8O年代和 9O年代十分活跃，但目前 -淀粉酶抑制剂的研究工作仍处于基础阶段，至今仍未得到有效合理的开发应用。-淀粉酶的生产工艺1 -淀粉酶的生产方法1.1生产方法的选择枯草杆菌 BF7658是我国应用广泛的液化型-淀粉酶菌种，国内普遍采用深层发酵法生产工业粗酶。我们从BF7658出发，用紫外光及化学药品反复交替诱变，选育适用于固体发酵的新菌体BF76581。该菌为短杆状，革兰氏阳性，两端钝园，在肉汁表面可生成菌膜，在培养基上菌落呈乳白色，表面光滑、湿润、

9、略有光泽，用碘液试之，菌落周围呈透明圈。第 1 页固体培养枯草杆菌 BF76581生产 -淀粉酶将菌种接种于马铃薯琼脂斜面， 37培养三天，然后转接到种子液体培养基上 （豆饼粉、玉米粉、酵母膏、蛋白胨火碱、水等），摇瓶培养一定时间，当菌体进入对数生长期时，以 0. 5%接种量接入固体培养基（麸皮、米糠、豆饼粉、火碱、水； ph=7左右，常压汽蒸一小时，冷却到 38 40）在厚层通风制曲箱内，通风保持 3742，培养 48小时出曲风干。麸曲用 1食盐水 34倍浸泡， 3小时后过滤，调节滤液 pH=8，加硫酸铵溶液沉淀酶，经离心，用浓酒精洗涤脱水， 40烘干、磨粉即为成品。深层发酵法生产 -淀粉酶

10、斜面菌种制法同前。将试管斜面菌种接种到马铃薯茄子饼斜面（培养基同前种子培养基）， 37培养三天，使之形成芽孢，以提高种子的稳定性。然后接种到 500升种子罐，37搅拌通风培养 1214小时。当菌体进入对数生长期（镜检细胞密集、粗壮整齐、大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液 =6.36.8，酶活 510单位毫升）时，乃转入 10000升发酵罐， 37，通风，搅拌，培养4048小时。中途三倍碳源的培养基补料，体积相当于基础料的1 3，从培养12小时开始，每小时一次，分30余次添加完毕。停止补料后68小时罐温不再上升，菌体衰老， 80形成空泡，每 23小时取样分析一次，当酶活不再升高，可结束发酵。

11、而后向发酵液中添加2%CaCl2，0.8%Na2HPO4，5055加热处理30分钟，以破坏共存的蛋白酶，促使胶体凝聚而易于过滤。冷却到35，加入硅藻土为助滤剂过滤。滤液加2.5倍水洗涤，洗涤同发酵液混合，真空浓缩数倍后，加（ NH4 ）2SO4盐析，盐析物加硅藻土后压滤，滤饼于40烘干，磨粉而成。按此工艺，由酶液到粉状酶制剂的收率为70。对于固体发酵有以下缺点：1. 限于低湿状态下生长的微生物，故可能的流程及产物较受限，一般较适合于真菌。2. 在较致密的环境下发酵，其代谢热的移除常造成问题，尤其是大量生产时，常限制其大规模的产能。3. 固态下各项参数不易侦测，尤其是液体发酵的各种探针不适用于固

12、体发酵， pH值、湿度、基质浓度不易调控， Biomass不易量测，每批次发酵条件不第 2 页易一致，再现性差。4. 不易以搅拌方式进行质量传递，因此发酵期间，物质的添加无法达到均匀。5. 由于不易侦测，从发酵工程的观点来看，许多工作都只是在定性或观察性质，故不易设计反应器，难以量化生产或设计合理化的发酵流程。6. 固体发酵的培养时间较长，其产量及产能常低于液体发酵。7. 萃取的产物常因黏度高不易大量浓缩。 而对于发酵罐深层培养具有生产周期短、产量高、效益大等优点故选用层发酵法生产 -淀粉酶。1.2 -淀粉酶培养基的制作（ 1）培养基的类型培养基的种类很多， 可以根据组成、 状态和用途等进行分

13、类， 按照用途可以分成孢子培养基， 种子培养基和发酵培养基。 微生物大规模发酵设计主要用到孢子 ,种子和发酵培养基这三种类型。（ 2）孢子培养基孢子培养基配制的目的是供菌体繁殖孢子的， 常采用的是固体培养基， 对这类培养基的要求是能使菌体生长快速， 产生数量多而优质的孢子， 并且不会引起菌体变异。对孢子培养基的要求： 营养不要太丰富； 所用无机盐的浓度要适量；注意培养基的 pH和湿度。-淀粉酶的孢子培养基配置如下：将麸皮 5、豆饼粉 3、蛋白胨 0.25%、琼脂 2%（pH 7.1）制成斜面培养基，在 0.1MPa蒸汽灭菌 20 min 。（ 3）种子培养基种子培养基是供孢子发芽、 生长和大量

14、繁殖菌丝体， 并使菌丝体长得粗壮成为活力强的种子。 对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全， 氮源和维生素的含量也比较高些， 浓度以稀薄为好， 可以达到较高的溶解氧， 供大量菌体生长和繁殖。-淀粉酶的种子培养基的配置：将豆饼 1%、蛋白胨和酵母膏各 0.4%、氯化钠 0.05%配置成种子培养基 (pH 7.1 7.2)，在 0.1MPa蒸汽灭菌 20 min。（ 4）发酵培养基发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求，第 3 页使菌种迅速生长、 健壮，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的能力，但要注意成本和能耗。-淀粉酶的发酵培养基配方是：麸皮70、小米糠 2

15、0、木薯粉 10%、烧碱0.5%，加水使水量达 60，常压蒸汽灭菌 1h.本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵。设计流程如下：孢子锥形瓶种子罐发酵罐（ 1）孢子制备将保存在淀粉琼脂斜面上的枯草芽孢杆菌孢子用无菌水洗下， 接种到锥形瓶中，在 35静置培养 24天，待长出大量孢子后作为接种用的种子。(2)种子制备将保藏的菌种接种到马铃薯茄子瓶斜面（20%马铃薯煎出汁加 MgSO4·7H2O5 mg/L，琼脂 2%，pH 6.77.0）， 37培养 3天。然后接入到 20L种子罐， 37搅拌，通风培养 1214小时。此时菌种进入对数生长期（镜检细胞密集，粗壮整齐，大多数细胞单独存在，少数

16、呈链状，发酵液pH 6.3 6.8,酶活 510U/mL ），再接种到发酵罐。(3)发酵罐培养培养基的配制：用麦芽糖液配置成含麦芽糖6、豆粕水解液 6 7、Na2HPO4·12H2O0.8、 (NH4)2SO4 0.4、 CaCl2 0.2、 NH4Cl0.15 、豆油1kg、深井水 20L ，调 pH 至 6.5 7.0。发酵罐培养基经消毒灭菌冷却后接入3%5%种子培养成熟液。培养条件为：温度 37± 1，罐压 0.5kgcm2，风量 1 20h 为 1：0.48vvm，20 h后1：0.67vvm，培 养 时 间 为 28 36 h 。1.2.1耐高温 - 淀粉酶的生产

17、方法耐高温淀粉酶生产工艺，采用地衣芽孢杆菌为菌株，通过一级种子罐发酵、大罐发酵、过滤、成品处理制得。1.2.2耐高温 - 淀粉酶的生产原料有采用地衣芽孢杆菌（ Bacilluslicheniformis ）1.5 吨种子罐发酵，玉米淀粉 6%10%，玉米浆 1%3%，豆粕 2%5%，磷酸二氢钾 0.3%0.6%，磷酸氢二钾 0.5%2%，柠檬酸钠 0.1%0.3%，35 吨发酵罐发酵 , 玉米淀粉 15%30%，玉第 4 页米粉 5%10%，豆粕 1%8%，玉米浆 2%5%，磷酸二氢钾 0.1%0.8%，磷酸氢二钾 0.8%2%，柠檬酸钠 0.05%0.4%等。1.2.3 耐高温 淀粉酶培养基

18、制作（ 1） 选取菌种：采用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis) 。（ 2） 1.5 吨种子罐发酵 ，培养基配方： 玉米淀粉 6%10%，玉米浆 1%3%，豆粕 2%5%，磷酸二氢钾 0.3%0.6%，磷酸氢二钾 0.5%2%，柠檬酸钠0.1%0.3%，余量为水，各组分以重量百分比计；加高温淀粉酶液化，消后pH6.2-6.5；用茄子瓶接入种母，温度 37±1，通风量 25-40m/h， pH 值 6.4，培养时间 24-36 小时。（ 3） 35 吨发酵罐发酵， 培养基配方：玉米淀粉 15%30%，玉米粉 5%10%，豆粕 1%8%，玉米浆 2%5%，磷酸二氢

19、钾 0.1%0.8%，磷酸氢二钾 0.8%2%，柠檬酸钠 0.05%0.4%，余量为水，各组分以重量百分比计；加高温淀粉酶液化，pH6.2-6.4；温度 42±1，风量 400-1000m/h，pH 值 6.4-6.8，培养时间 80-100 小时；在上述条件下补料分批发酵：以淀粉浓度为150280g/L 为发酵初糖浓度，以质量百分比40%70%的淀粉糖溶液作为发酵补料物，在DE 值降至1060mg/ml 时以阀门开启程度的大小为依据开始持续流加补料，维持发酵液中DE 值约为 1060mg/ml，控制总糖浓度达到220320g/L 时停止补料。（ 4） 提取浓缩工艺：经絮凝、压滤，二

20、次过滤后，采用超滤膜浓缩，保持料液浓缩过程中温度 20 45；最后采用精滤板框过滤机，配合硅藻土预涂工艺进行过滤除菌，最终生产出成品。1.2.4耐高温 - 淀粉酶的另一种生产方法向成熟的发酵液中加入占发酵液重量 1-3的钙离子保护剂或 2-5淀粉中的至少一种，在 70-90的条件下，进行热处理。将制得的纯化的耐高温。淀粉酶送至压力喷雾塔进行喷雾干燥， 制得酶粉，将酶粉调配后，分装即得成品。该耐高温。淀粉酶呈固体状态， 酶活力达 2 万单位 g 以上，具有较高的稳定性，易贮存和运输。1.2.5 用菌种枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）T2 来提取耐高温 淀粉酶枯草芽孢杆菌（ B

21、acillus subtilis ）是当今工业酶制剂的主要生产菌种之一，主要用于生产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。本实验利用高产淀粉酶的枯草芽第 5 页孢杆菌 T2 生产 淀粉酶。（一）用此菌种来提取淀粉酶的生产原料枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）T2，蛋白胨 5g，酵母膏 2.5g，葡萄糖 0.5g,可溶性淀粉 2.5g，KH 2PO4 1g，MgSO4.7H2O 0.25g，CaCl2.2H2O 0.1g，H2O 500mL，pH7.0。（二）此培养基的制备1.培养基的制备与灭菌发酵培养基： 蛋白胨 5g，酵母膏 2.5g，葡萄糖 0.5g,可溶性淀粉 2.5g，KH 2P

22、O41g，MgSO4 .7H2O 0.25g， CaCl2.2H2O 0.1g， H2 O 500mL，pH7.0。分装于 100mL锥形瓶中，每瓶50mL，121灭菌 20min。2. 接种与产酶培养接种环灼烧灭菌后， 轻轻刮取斜面种子培养基中的少量菌体， 接入液体培养基中，并使环在液体与管壁接触的部位轻轻摩擦， 使菌体分散于液体中。 37振荡培养 48 h。3. 离心将发酵液置高速冷冻离心机中10000r/min 离心 10 min，除菌体，上清液即为淀粉酶粗酶液。此上所诉由王梦韵所做2 -淀粉酶的菌种选育-淀粉酶生产：以枯草芽孢杆菌 14140 为出发菌株 ,经亚硝基胍反复多次处理和筛选

23、生产 -淀粉酶。分离纯化：以 CTAB/正丁醇 /异辛烷构成反胶团系统 ,通过反胶团萃取方式纯化精制 -淀粉酶。最佳反应条件为：萃取温度 40，水相组成为 NaCl0. 03 mol/L ， pH 12. 0，有机相：无机相 =12，振荡时间 10 min；反萃取最佳条件为：温度60，水相组成为KCl3 mol/L ，pH 4. 0，有机相无机相 =21，反萃取振荡时间 10 min。在上述条件下，经过一个萃取与反萃取循环后， -淀粉酶的萃取率最高可达 90. 78%。2.1 菌株与培养方法第 6 页2.1.1 培养基BY 斜面培养基每 100 g 含可溶性淀粉1 g ，牛肉膏 1 g，蛋白胨

24、 1 g，酵母膏 0.2 g，NaCl 0.5 g，琼脂 2 g. BY 发酵培养基每 100 g 含可溶性淀粉 5 g，牛肉膏 1 g，蛋白胨 1.5 g，酵母膏 0.2 g，NaCl 0.5g，CaCl21 g。调节 pH7.0，经 121，灭菌 30 min，备用。2.1.2 仪器设备全自动高压灭菌锅、 培养皿、恒温培养箱、 超净工作台、 恒温摇床、离心机、分光光度计、恒温水浴锅、移液管、 PH 试纸、吸耳球、玻璃棒、量筒、试管、试管架、酒精灯、电子天平、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、直尺、记号笔等。2. 2 实验方法221细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把 10-3 、 10-

25、4、10-5 分别涂布到淀粉培养基上， 27倒置培养 2 天，将长出的菌落接入斜面。将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2 天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d 值。保菌供下次实验用。222紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、 稀释；倒淀粉培养基平板， 将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板 0、 2min、 4min、 6min、 8min、 10min，每个处理 2 次重复；放到黑暗中倒置培养， 37培养 48h，分别计数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率； 加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算 D/d 值；将 D/d 值最大的菌种保存到

26、斜面培养基上。2.3 诱变方法以及变异菌株的筛选诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。以 NTG 为诱变剂，按一定处理剂量( g/ml)，在一定 pH 值的缓冲液中 30恒温振荡处理 14 h。经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。经稀释涂布在含有1%淀粉 BY 固体培养基上，经24 h 培养形成小菌落。把单菌落分别移植于含 2%淀粉 BY 液体培养基中， 30培养 36 h。用 2#定性滤纸制成 5 mm disc(小圆纸片 )，并用 2%琼脂 BY 培养基灭菌后第 7 页加入较大剂量青霉素 (抑菌 )。倒入 200 mm×300mm 长方形不锈钢玻璃培养皿中，

27、冷却凝固。然后把 5 mm disc 纸顺序放在培养基表面。用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc 上。把 disc 培养皿经37， 24h 分别培养。把 KI-I2 液用喷雾器均匀分布在disc 培养皿培养基的表面上， 并挑出淀粉水解圈大的 disc，用相对应的1 ml 培养液接种摇瓶，进行发酵测定酶活力。把各种斜面菌株经活化培养，接种于1%淀粉培养基的三角瓶中，进行摇瓶比较实验。将菌株作逐一对比，从中筛选出酶活较高的产酶菌株。经菌种诱变选育-淀粉酶高产菌株为诱变的出发菌株，经NTG 反复多次处理，并经淀粉水解圈初筛和摇瓶复筛，来选育-淀粉酶高产菌株。经 NTG 反复多次处理， -

28、淀粉酶活力有较大幅度提高。 在经 5 次 NTG 处理之后，其变异株 -淀粉酶活达到 34 200 (U/ml) ，较出发菌株提高了 4.2 倍以上，说明该诱变处理及选育方法是行之有效的。经 NTG 处理所得的变异菌株的产酶稳定性较差 ,必须经反复多次单菌落分离和摇瓶比较，逐渐筛选出产酶稳定性好的菌株。此上所诉由李艳梅所做3 -淀粉酶分离纯化 ：-淀粉酶分离纯化及活性测定方法粉酶分离纯化及活性测定方法粉酶分离纯化及活性测定方法粉酶分离纯化及活性测定方法3.1-淀粉酶的分离和纯化 ：高纯度 淀粉酶是一种重要的水解淀粉类酶制剂，可用于研究酶反应机理和测定生化反应平衡常数等。分离纯化淀粉酶的方法很多

29、，一般都是依据酶分子的大小、形状、电荷性质、溶解度、稳定性、专一性结合位点等性质建立的。要得到高纯度淀粉酶，往往需要将各种方法联合使用。盐析沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析和电泳等，是蛋白质分离纯化第 8 页的主要方法。通过超滤、浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳，对利用基因工程菌生产的重组超耐热耐酸性 一淀粉酶进行纯化， 得到电泳纯级的超耐热耐酸 一淀粉酶，纯化倍数为 11.7，活力回收率为 29.8%。但上述方法存在的共同问题是，连续操作和规模放大都比较困难。反胶团萃取具有选择性高、 正萃与反萃可同时进行、 分离与浓缩同步进行、 操作简单和易于放大等优点，并能有效

30、防止生物分子变性失活。以CTAB / 正丁醇 /异辛烷构成反胶团系统， 通过反胶团萃取方式纯化精制 -淀粉酶。最佳反应条件为 : 萃取温度 40 ， 水相组成为 NaCl 0.03 mol/L ，pH 12.0，有机相：无机相 = 1：2， 振荡时间 10min；反萃取最佳条件为 :温度 60， 水相组成为 KCl 3 mol/L ，pH 4.0, 有机相：无机相 = 2： 1， 反萃取振荡时间 10 min 。在上述条件下，经过一个萃取与反萃取循环后，淀粉酶的萃取率最高可达 90. 78%。双水相技术具有处理容量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点。应用双水相系统PEG磷酸盐分离纯化 淀

31、粉酶，增加PEG 浓度有助于酶富集上相。同样用PEG磷酸盐双水相体系从发酵液中直接萃取分离低温一淀粉酶，分配系数及回收率分别为 4.8 和 87。采用 PEG(聚乙二醇 )硫酸铵双水相体系，进行分离纯化淀粉酶，结果表明，在室温下由 PEG 和硫酸铵所组成的双水相体系，对 淀粉酶的回收率可达 94.84，分配系数可达 17.10。双水相技术有着溶液粘度高、 分相时间长，易造成界面乳化等缺点， 给实际操作带来很多问题。 为了获得高纯度的 一淀粉酶，开始人们利用软基质的离子交换色谱和亲和色谱分离纯化了 -淀粉酶的粗酶提取液。但是，软基质色谱介质的机械强度小，受压易变形，分析速度慢，分离效率低，柱寿命

32、短，固定相对 PH、离子强度和压力非常敏感，反复使用时配体碎片容易脱落。 由于以上缺点， 软基质色谱有逐渐被硬基质色谱取代的趋势。在硬基质色谱应用方面， 李华儒等首次合成一种对 一淀粉酶具有特异亲和能力的色谱介质， 并成功地分离纯化了工业粗酶， 获得了高纯度产品， 其活性回收率 >88%，Kato 等也用高效疏水色谱纯化了 -淀粉酶粗品，回收率为90%。之后其采用高效液相离子交换色谱纯化 一淀粉酶很好地分离了 一淀粉酶粗品， 其活性回收率高达 96%，比活性达 388/mg 蛋白质。此法的研究成功为大规模制备高纯度 一淀粉酶提供了一个新工艺路线。3.2 实验方法第 9 页（1）反胶团系统

33、的配置将适当比例的正丁醇和异辛烷加入比色管，摇匀。再加入适量 CTAB，放入加热套中加热溶解， 摇匀，使其均匀分布于有机相，得到澄清透明稳定的反胶团系统。（2）前萃取将 -淀粉酶溶解于不同缓冲液中，稀释，并用4 层洁净纱布滤清。磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液， pH(pI) ，构成初始水相。将反胶团相和水相置于 50 mL 带塞三角烧瓶中， 在振荡器上剧烈摇晃后 (250 r/min, 10 min)，倾入离心管，进行离心 (3 500 r/min, 5 min) ，用滴管小心地将两相分开取上层有机相待用。（3）反萃取用去离子水配制适当pH 值 (pH<pI) 和离子强度的缓冲液作为反萃取水相， 与前萃取所得的有机相混合， 放入恒温水浴锅加热片刻， 在振荡机上剧烈摇晃后 (250 r