实验性自身免疫性脑脊髓炎豚鼠鼻粘膜免疫耐受研究

1、    实验性自身免疫性脑脊髓炎豚鼠鼻粘膜免疫耐受研究        【摘要】目的探讨鼻粘膜摄入髓鞘碱性蛋白(MBP)抗原诱导免疫耐受，在抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的发生中的作用及其机制。方法先使豚鼠经鼻粘膜摄入MBP，诱导建立外周免疫耐受，然后用MBP加完全弗氏佐剂(CFA)免疫豚鼠，观察动物的临床症状、E花环形成试验、淋巴细胞转化试验、迟发型超敏反应(DTH)、细胞因子水平及病理改变。结果鼻粘膜免疫耐受可有效地阻止EAE发生，耐受组动物E花环形成试验、淋巴细胞

2、转化试验及DTH反应明显受到抑制，外周血淋巴细胞培养后测得白细胞介素-4 (IL-4)水平明显升高，-干扰素(IFN-)水平则明显降低。结论经鼻粘膜摄入小量自身抗原是诱导疾病免疫耐受的有效途径，可能为多种自身免疫病的防治提供有希望的方法。推测鼻粘膜免疫耐受可能与Th1反应及促炎症性细胞因子，如IFN-分泌下调、Th2反应及抗炎症性细胞因子，如IL-4分泌上调有关。【关键词】脑脊髓炎，变应性鼻粘膜 致脑炎碱性蛋白质类 白细胞介素4 免疫耐受 A study of nasal administration of myelin basic protein of prevents experiment

3、al autoimmune encephalomyelitis in guinea pigsWANG Weizhi, WANG Lihong, YANG Qiuxia, et al. Department of Neurology, The Second Affiliated Hospital, Harbin Medical University, Harbin 150086【Abstract】ObjectiveTo explore the mechanism of nasal tolerance by nasal administration of myelin basic protein

4、(MBP) in guinea pigs for inducing immune tolerance and preventing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). MethodsGuinea pigs were, to begin with, given MBP through the nasal route to induce the development of peripheral immune tolerance, and then immunized with specific antigen MBP plus com

5、plete Freund's adjuvant (CFA). The clinical symptoms of guinea pigs were investigated, and the erythrocyte rosette test, and lymphocyte blastogenesis test, the MBP-specific skin delayed-type hypersensitivity (DTH) response and the levels of interlukin-4 (IL-4) and interferon- (IFN-) were also de

6、tected, and the pathological changes were examined as well. ResultsNasal tolerance could effectively prevent the development of EAE clinically. The erythrocyte rosette test, lymphocyte blastogenesis test and MBP-specific skin DTH response were also obviously suppressed. An evident increasing of IL-4

7、 level while a decreasing of IFN- level was found after the culture of peripheral blood lymphocytes. ConclusionThis experimental study suggested that the nasal administration of small amount of antigens had been a highly efficient approach in inducing clinical relevant tolerance, and it might provid

8、e a simple and promising way for the protection and treatment of a number of many autoimmune diseases, including EAE. It was suspected that the suppression of EAE in this experimental study might be associated with down-regulation of the Th1 response or secretion of proinflammatory cytokines, i.e.,

9、IFN- and with up-regulation of the Th2 response or secretion of anti-inflammatory cytokines, i.e., IL-4.【Key words】Encephalomyelitis，allergic Nasal mucosa Encephalitogenic basic proteinsInterleukin-4Immune tolerance大量动物实验已证明，口服免疫耐受可以抑制多种实验性自身免疫病的发生1-4，然而口服免疫耐受用于人类自身免疫病治疗的实际应用价值却非常有限，因其所需耐受原剂量很大，作用时间

10、短，且价格昂贵。以霍乱毒素B亚单位(CTB)为载体的口服免疫耐受5，虽可减少耐受原用量，但CTB是否会产生毒副作用还有待观察。目前，经鼻粘膜摄入抗原作为一种新的耐受诱导方式日益受到人们的关注6-8，但口服及鼻粘膜耐受机制均不清楚。本实验观察了经鼻粘膜免疫耐受的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE) 豚鼠的临床表现、E花环形成试验、淋巴细胞转化试验、迟发型超敏反应(DTH)、细胞因子水平变化及病理改变，探讨其发生机理。材料和方法一、鼻粘膜免疫耐受的诱导6周龄成年雌性豚鼠21只，体重180230 g。分为耐受组、非耐受组和正常对照组，每组7只。耐受组豚鼠乙醚麻醉后，用微量加样器取含牛髓鞘素碱性蛋白质(

11、MBP, 800 g/ml)磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.4) 60 l，缓慢滴入两侧鼻孔。非耐受组及正常对照组滴入同体积的PBS，每天1次，连续10天。二、EAE模型的制备及临床症状评分标准耐受诱导3天后，耐受组和非耐受组以牛-MBP 600 g溶于300 l PBS，然后乳化于等量完全弗氏佐剂(CFA)中，豚鼠每侧足跖皮下注射0.3 ml。正常对照组豚鼠以PBS加CFA用相同方法免疫。采用双盲法由两人对其临床症状作临床评估，并每天称量体重。临床评分参照Weiner等的修正标准9：0级为未发病；1级为后肢轻度瘫痪；2级为后肢中度瘫痪；3级为后肢重度瘫痪伴尿便失禁；4级为3级加前肢瘫痪；5

12、级为濒死状态或死亡。三、免疫反应及细胞因子检查1DTH：MBP加CFA免疫豚鼠后14天，在豚鼠一侧耳廓注射MBP溶液100 l(含量100 g)，注射前、后48小时用双盲法分别用微量卡钳测耳厚度。2E花环形成试验和淋巴细胞转化试验：免疫后16天，采豚鼠外周血按常规方法做E花环形成试验和淋巴细胞转化试验。3白细胞介素-4（IL-4）及-干扰素（IFN-）测定：免疫后16天采豚鼠外周血进行淋巴细胞培养，48小时后测IL-4水平；72小时后测IFN-水平，按IL-4及IFN- ELISA 试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司提供)程序进行。四、病理学检查免疫后16天在乙醚麻醉下取豚鼠脑和脊髓，甲醛固定，

13、2周后取材，重点观察脑室周围、脑干和小脑，脊髓分颈、胸、腰三段观察，并进行HE染色、Weil髓鞘染色及苯胺蓝桔黄剂髓鞘染色，病理积分以小血管周围的炎性细胞浸润灶数目加脑脊髓白质中脱髓鞘灶数目来表示。结果1临床表现：耐受组仅有1只豚鼠轻度发病，临床评分为0.5分；非耐受组有6只豚鼠发病，临床评分为24.5分；正常对照组均未发病。EAE发病潜伏期为811天，潜伏期短者病情重，潜伏期长者病情轻。发病动物主要临床表现是精神萎糜、进食减少、体重下降、后肢瘫或四肢瘫，可伴尿便失禁，严重者出现震颤、抽搐、意识障碍和死亡。耐受组与非耐受组动物临床评分经H检验，有显著性差异(表1)。表1三组临床积分、病理积分及

14、DTH结果(M±A)分组豚鼠(只)临床积分病理积分DTH(cm10-2)耐受组70.00±0.070.00±0.431.70±0.40非耐受组73.00±0.6413.00±1.004.40±0.17正常对照组70.00±0.000.00±0.000.60±0.07H值9.109.1117.64P值<0.05<0.05<0.01注：M±A代表中位数±平均差，下表同2DTH测定结果：如表1所示，耐受组豚鼠MBP特异性DTH反应明显受到抑制，与非耐受组之间有差异

15、有极显著意义 (P<0.01)。3E花环形成试验和淋巴细胞转化试验：耐受组E花环形成细胞数和淋巴细胞转化百分率明显少于非耐受组，H检验二者间差异有极显著意义(P<0.01)，见表2。4细胞因子测定结果：耐受组IFN-水平明显低于发病组，IL-4水平明显高于发病组，H检验均有差异极显著意义 (P<0.01)，见表2。表2三组淋巴细胞转化试验、E花环形成试验、IL-4及IFN-结果(M±A)分组淋巴细胞转化试验(%)E花环形成试验（%）IL-4(pg/ml)IFN-(pg/ml)耐受组19.00±3.8635.00±5.7185.64±11

16、.2227.54±6.61非耐受组40.00±0.8670.00±4.8622.31±2.1980.10±2.52正常对照组18.00±0.8635.00±2.1480.69±2.6826.20±1.15H值11.8111.8014.1814.52P值<0.01<0.01<0.01<0.01注：各组豚鼠数均为7只5病理检查：非耐受组临床评分为4.5分的1只EAE豚鼠大体所见：脑脊膜弥漫性水肿，脑回变宽、脑沟变窄。显微镜下可见：脑脊膜充血，散在淋巴细胞浸润，脑脊髓实质内小血管周围和蛛

17、网膜下腔内有大量炎细胞浸润，并形成袖套(cufing)状改变，小血管管壁和管周间隙有炎细胞积聚，内膜和外膜均有增生，并可发生纤维变性和坏死，可见到小片状出血灶。髓鞘染色可见脑及脊髓白质有轻重不等的髓鞘崩解与脱失，以侧脑室前角及侧角周围的白质、脑干、小脑及脊髓腰段等处白质为重。脱髓鞘病灶区可见髓鞘肿胀、变粗，粗细不等，基本全部脱失；轴索相对完整，也有肿胀及粗细不等，有的轴索崩解、消失。耐受组只有1只豚鼠有上述部分病变，但程度较轻。耐受组豚鼠的病理积分明显低于发病组，H检验有显著性差异(表1)。讨论EAE是MS的经典动物模型，是由CD+4 T淋巴细胞介导的，以中枢神经系统(CNS)血管周围单个核细

18、胞(MNC)浸润和白质脱髓鞘为特征。本实验用牛MBP有效地诱导豚鼠建立了鼻粘膜免疫耐受，使之获得抵御EAE的能力。耐受组动物的临床评分和病理积分均显著低于非耐受组，证明鼻粘膜免疫耐受在抑制动物自身免疫病的临床发病及症状严重程度方面有肯定的作用，并经病理学检查证实。与口服免疫耐受相比，鼻粘膜免疫耐受具有更有效、所需耐受原剂量更小的优点。皮肤DTH反应是由CD+4 T细胞亚群介导的炎症反应，研究者常通过测定对特异抗原的皮肤DTH反应受抑制来证明免疫耐受的建立。多数研究发现，EAE的发生与抗髓鞘素抗原DTH反应之间有显著的相关性。本实验耐受组豚鼠MBP特异性DTH明显受到抑制，提示经鼻粘膜给予MBP

19、能抑制MBP诱导的CD+4 T淋巴细胞反应。耐受组E花环形成试验及淋巴细胞转化试验均明显低于非耐受组，与正常对照组极为接近，提示免疫耐受动物的细胞免疫激活程度明显降低，也说明EAE发病与免疫调节异常有关。鼻粘膜免疫耐受可能纠正这种免疫失衡状态，阻止或治疗自身免疫病。本实验结果显示，耐受组豚鼠外周血IFN-水平明显低于非耐受组，而IL-4水平则明显高于非耐受组，提示鼻粘膜免疫耐受能抑制EAE的发病可能与Th1反应受抑制或促炎症性细胞因子，如IFN-的分泌下调及Th2反应增强或抗炎症性细胞因子，如IL-4的分泌上调有关，IL-4等抑制性细胞因子可非特异地抑制靶器官的免疫病理反应。自身免疫病是一组病

20、因未明的疾病，其发病受遗传及环境因素的多重影响。但不论以细胞免疫或体液免疫为主所介导的自身免疫病，T细胞均起关键性作用。Th1/Th2亚群的转换是机体免疫应答的正常生理功能，参与免疫调节过程，Th1/Th2平衡的偏离与许多自身免疫病的发病密切相关。EAE是CNS炎症性自身免疫病，用CNS髓鞘蛋白MBP或含脂质蛋白(PLP)免疫大鼠或豚鼠均能造成EAE模型，EAE模型还可通过MBP或PLP特异性CD+4 T细胞过继转移而产生。对转移的致病性T细胞的克隆分析发现，这类T细胞可产生Th1细胞因子10。相反，自发恢复的EAE大鼠则伴有Th2样细胞及其细胞因子的明显增加。总之，经鼻粘膜摄入小量自身抗原可

21、有效地诱导外周T细胞的免疫耐受，为EAE、实验性自身免疫性重症肌无力、实验性自身免疫性关节炎、实验性自身免疫性葡萄膜炎和非肥胖型小鼠糖尿病等多种自身免疫病的防治提供了一种简单而很有希望的途径4。但本组也看到人工免疫耐受效应还不完全，仍有待于进一步改进方法加以完善，使之能够真正用于人类自身免疫病的防治。本课题受国家自然科学基金(No.39570676)资助作者单位：王维治王丽宏哈尔滨医科大学附属第二医院神经科150086杨秋霞免疫学教研室杨春娥病理学教研室参考文献1Whitacre CC, Gienapp IE, Orosz CG, et al. Oral tolerance in experi

22、mental autoimmune encephalomyelitis III. Evidence for clonal anergy. J Immunol, 1991, 147:2155-2163.2Meyer Al, Benson JM, Gienapp LE, et al. Suppression of murine chronic relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis by the oral administration of myelin basic protein. J Immunol, 1996, 157:4230

23、-4238.3Ma CG, Zhang GX, Xiao BG, et al. Mucosal tolerance to experimental autoimmune myasthenia gravis is associated with down-regulation of AChR-specific IFN- expressing Th1-like cells and up-regulation of TGF- mRNA in mononuclear cells. Ann N Y Acad Sci, 1996, 788:273-287.4王维治. 神经系统自身免疫病的口服免疫耐受. 医

24、学进展, 1997, 2:5-9.5Sun JB, Rask C, Olsson T, et al. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis by feeding myelin basic protein conjugated to cholera toxin B subuint. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:7196-7199.6AI-Sabbagh A, Nelsion PA, Akselband Y, et al. Antigen-driven peripheral immune tolerance: Suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis and collagen-induced arthritis by aerosol administration of myelin basic protein or t