腺病毒包装注意事项

1、在293细胞中大量扩增腺病毒一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在293细胞中进行大量扩增。本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法，按这一方法最终得到的病毒量约为3 X 10113 X 1012。由于一个细胞中所含的病毒颗粒为100010000，因此1L培养细胞可得到约5 X 1012病毒颗粒。如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化，则必须至少3 X 108的细胞，这样才能正确分辨岀病毒带。对于蛋白表达，则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提（根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀）。为优化时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。如果由于

2、各种原因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。注意 每次扩增都将会剩下一些病毒，这些病毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。每次扩增最好都 用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。操作步骤:在100mm 培养皿或75cm2 培养瓶中加入10ml DMEM5% 培养5 X 106293 细胞。取0.5UI首次扩增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混匀，这样稀释得到的MOI值约为5。移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3次，37 C CO2孵箱中培养90分钟。4 加入 9ml DMEM5% 。5再培养72小时，这时在1

3、0ml溶液中大约有5 X 1095 X 1010个病毒颗粒，进行 MOI测定以估计病毒颗粒。注：如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。收集细胞,600 X g离心5分钟沉-200C淀细胞，去上清后加入最小体积（一般为原始体积的1/10即1ml）病毒保存溶液重悬细胞。/370C冻融3次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。1 -20 C /37 C冻融 3 次。10分钟，收集上清冻存于-20 C或2转入15ml无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心 -80 C。3 3个175cm2培养瓶中各加入107 293细胞进行培养。4将3ml细胞裂解液上清加

4、入12ml DMEM5% 中，混匀。移去细胞培养液，每瓶小心加入5ml混合液，十字形慢慢晃动混匀 3次，370C 5%CO2 孵箱中培养90分钟。此时MOI值约为25。5 加入 DMEM5% 至 30ml。6再培养4872小时。此时10ml培养液病毒量约为 3X 10103X 1011。若需要，进行MOI测定以估计病毒滴度。注：如果此时病毒量已可以满足实验所需，则可立即进入病毒滴定步骤。600X g离心5分钟收集细胞，弃上清，加入1/10原始体积的溶液重悬细胞。-200C /370C 冻融3次，台式离心机上以最 大速率沉淀细胞碎片，收集上清，进行病毒滴定。12.移入50ml离心管中，台式离心机

5、上最大速率离心10分钟，取岀上清保存。13. 30瓶175 cm2 培养瓶中每瓶各加入107 293 细胞。14.将45ml细胞裂解液上清加入105ml DMEM5% 混匀，从培养瓶中移去培养液，加入 5ml混合液感染细胞，十字形缓慢晃动 3次混匀，370C培养90分钟。此时MOI值约为25。15.加入 DMEM5% 至 30ml/ 瓶。16.再培养48-72小时，此时约有3X 10113X 1012个病毒。若需要，进行 MOI测定估计病毒滴度。I如果要收集病毒颗粒，先收集被感染细胞，然后重悬在5ml DMEM5% 中。-200C /370C冻融3次,离心沉淀细胞碎片。此时 5ml DMEM5

6、%中3 X 10113 X 1012个病毒颗粒，浓度为6 X 1010 6 X 1011Vp/ml 。然后测定病毒滴度，或者用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。在109细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液，而在1010细胞中扩增则有一定技术性。切勿将扩增后的病毒保存液再用来感染细胞，因这会大大增加RCA产生量。有时不得不使用纯化空斑以最大可能降低RCA产量。如果已没有纯化的空斑，那么就不得不重新空斑纯化重组病毒，鉴定克隆后再进行扩增。如果需要大于扩增 4轮后的病毒量，注意请用早期的病毒作为扩增源。比如，用第2代病毒产生第3代病毒。如果没有第 2代病毒，那么必须用第1代病毒来产生新的第2代病毒。

7、按这个原则进行扩增可使RCA水平尽可能低。如果用于表达蛋白，则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。细胞沉淀中一般可提取1-5mg蛋白，建议在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间，然后再大量扩增蛋白。工代a邑就1-10SS-iW1訂or唾黑武尢小7S1刑ITS1A 土用1乳1J30莊的空呵S三临D保右靜0.4 1 也 SRO S mL 或0 1 rni1 mL15mL2弘帼1 mL10 nJ.WD mLM0*§?5S虞阿伽iLji5-109-103-1D1D-112.5.2转染具体操作按 Tran sFastTM Tran sfection Reage nt（Prom

8、ega ）的操作手册进行。转染在 24孔细胞板上进行，在转染的前一天，消化 HEK-293A细胞，用10%的新生牛血清DMEM（不含抗生素）稀释细胞，使其密度达到2.5 X 105个细胞/mL ,在24孔细胞板上每孔接种1.0mL，5%CO2、37 C饱和湿度下培养；在转染前 4h，把24孔细胞板的营养液更换为新的营养液；取岀-20 C保存的转染试剂，室温融化并涡漩；在灭菌的玻璃瓶中先加入 200丄37 C预热的0PTI-MEM无血清培养基（或不含血清的 DMEM ），然后加入1.0 e的DNA，混匀后加入 3.0此的TransFastTM TransfectionReage nt （使lip

9、id : DNA的体积/让与质量/ e比为1 : 1）后立即涡漩，在室温温育 Tran sFastTMTransfection Reagent/DNA混合物1015min ；从二氧化碳细胞培养箱中取岀细胞板，弃去上清;再一次短暂涡漩 TransFastTM Transfection Reagent/DNA混合物，把混合物轻轻加入到细胞面上,注意不要直接吹到细胞面上，以免细胞脱落；轻轻混匀，使脂质体/DNA混合物覆盖细胞面，然后立即把细胞板放入二氧化碳培养箱中；温育1.0h后,轻轻加入1.0mL 37 C预热的完全生长液（或使血清浓度降到26% ），把细胞放入二氧化碳培养箱,37 C培养714d

10、。2.5.3重组腺病毒的收获与增殖当转染的细胞岀现特征病变（局部细胞变圆、脱落,成网状）或细胞状态不足以维持时，-存收获病毒。冻融后接种长满293A细胞的6孔细胞板，37 C吸附1.0h，每孔加入2.0mL维持液（含2%血清的DMEM），增殖病毒。线性DNA转染只有在包装成病毒后才能表达 GFP,至少也得5d左右般短时间病毒可以保存在-20度，但是病毒最好在-80 C保存，特别是纯化之后。在最佳的缓冲液(10mM Tris HCI pH 8.0, 2 mM MgCI2, 4% sucrose）病毒会持续1-2年稳定性；病毒不能反复冻融；建议不要在-20 C下长期保存。病毒在DMEM中用血清保存

11、的方式与纯化颗粒一致,但通常比在缓冲液中更加稳定。 可以在DMEM中用血清在4C存储病毒一周以上而不需要反复冻融。病毒在DMEM中可以反复冻融30次以上而滴度不会下降，在经过纯化的病毒的情况下，使用缓冲液存储于-80 C下滴度就会至少下降一个数量级（视保存缓冲液而定）。缓冲液和精确的PH值对于滴度的保存是很关键的。最佳的保持稳定性的储存方法建议使用以下缓冲液:Tris 10mM ,pH 8.0, 2mM MgCl2 ，4% sucrose般转染后几天之内可以看到零星、散在的荧光，在转染后5d以后，如果有腺病毒包装，由于其感染周围的细胞，那么会在腺病毒包装的地方看到荧光数增加，聚集成一团的样子。

12、随着时间的延长， 整个视野荧光数会逐渐增多。转染后荧光数不增加或不明显，这与病毒包装的过程有关。如果包装很快，那么很快就能看到明显的荧光。毕竟不同转染条件、不同目的基因，包装速度是不一样的。如果细胞没有CPE,细胞状态好的话，可以尽可能地将时间延长，一直维持就可以。有时候第一代都看不到明显的CPE,等细胞不能维持时，冻融再接一代有时就明显了。刚转染之后也能看到散在的荧光，包装成功是能看到成团的荧光，当然CPE是最确切的证实。能否包装成功与目的基因也有很大关系，据不完全统计，在腺病毒包装公司，大约有将近10%是不能成功的。当基因对腺病毒有害时常常会岀现这种情况。时间长短与你的转染量、转染效率、基

13、因都有关 系。CPE的具体表现为：细胞变圆、脱落，形成空斑。有时候第一代很难看到，最后时间长了，与对照细12d都CPE 了）。即使胞差别不大，往往病变难以确定，需要传代一次才会变得明显。液体变黄是正常的，只要感觉细胞还行就可以。这个过程一般不需要换液，细胞好可以维持 可以。如果觉得不能维持了，可以换液，因为此时上清的病毒很少（多的话，早就有 到后来，也是细胞中的病毒量高。 我的质粒提取方法重组质粒的小量提取1.挑取转化DH5a的单个菌落，接种于盛有 3.0mL的含50 QmL （或加倍）氨苄青霉素的 LB培养基的试管中，37 ° C 220rpm 过夜振荡培养（一般12-16h，如果

14、浓度低可适当延长时间）2.取1.5mL菌液，12000rpm 离心30s，沉淀菌体（我一般重复 2次，也就是3ml离心在一个EP管；试剂盒提我重复4次，也就是说6ml过一个柱子）；（不用担心裂解不开）3.完全弃去上清后加入 300丄4 C预冷的溶液I （50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L Tris-Cl，pH8.0 ;10mmol/L EDTA )重悬细菌;4.加入新配制的溶液II 300让（0.2mol/L NaOH ;1%SDS ），缓慢颠倒离心管数次，将离心管置于冰上;5.加入225让用冰预冷的溶液山（5mol/L乙酸钾60mL，冰乙酸11.5mL，水 28.5Ml ），盖紧管口

15、,将管倒置后温和颠倒至蛋白变性成白色团块，置冰上3 5min ；6.12000rpm 离心5min，将上清移至新的离心管中;7.加入 1-2RNase A (10mg/mL )，37 C作用 30min 或延长至60min ；8.加入600 （jL的酚：氯仿，颠倒混匀后置室温 5min，12000rpm离心 5min ；9.取上清到新的离心管，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min ；10.12000rpm 离心l0min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，干燥，加入30丄双蒸水溶解;11.琼脂糖凝胶电泳分析。转染后48h看不到荧光也算是正常的，但是细胞第 7天就死亡肯定是不正常的。

16、是不是转染量过大,导致脂质体太多，对细胞的毒性太大造成的，或者是细胞状态不好，没有转染的细胞对照是不是好的 呢？1） pacI酶切线性化的体系可以参照一般的酶切体系，我一般是30ul，效果挺好。可以放大到 50ul ,但不宜过大，使得酶浓度降低；也不宜过小，以免有些成分抑制酶切。一般在酶切3h （或者更长）后，取几微升（如3ul）与没有酶切的质粒一起跑电影，一看是否切成了2条带,二看质粒的带型还有没有，如果质粒的带子不见了，全部切成了大片段和小片段2条带，就认为酶切完全，此时可以再延长酶切一段时间。2） 50-70%汇片指的是细胞融合度在 50-70%，这些都是凭感觉，时间长了就掌握了。 50

17、-70%指细胞间隙还是比较大的，不知道你用的什么转染试剂，好像没见要求密度这么小的。3）不同转染试剂的步骤一般都不一样，一般参考说明书就行。条件允许，可以多转染几个孔，采用不同的细胞稀释度进行转染。脂质体与DNA的比例一般采用推荐的就可以，当然也可以先用GFP质粒摸索一下。这是我用的 Tran sFastTM Tran sfection Reage nt(Promega )的步骤:2.5.2转染具体操作按 Tran sFastTM Tran sfection Reage nt（Promega ）的操作手册进行。转染在 24孔细胞板上进行，在转染的前一天，消化 HEK-293A细胞，用10%的新

18、生牛血清DMEM （不含抗生素）稀释细胞，在24孔细胞板上每孔接种1.0mL（这个地方可以灵活点，一般一瓶满的细胞消化后加20-30ml营养液，每孔加0.8-1.2ml ），5%CO2、37 C饱和湿度下培养；在转染前 4h，把24孔细胞板的营养液更换为新的营养液；取岀-20 C保存的转染试剂，室温融化并涡漩；在灭菌的玻璃瓶中先加入200此37 C预热的OPTI-MEM 无血清培养基（或不含血清的 DMEM ），然后加入1.0的DNA，混匀后加入 3.0(J_ 的 Tra nsFastTM Tran sfecti onReage nt (使 lipid : DNA 的体积 / jjL 与质量/

19、 j比为1 : 1）后立即涡漩，在室温温育 TransFastTM Transfection Reagent/DNA 混合物l015min ；从二氧化碳细胞培养箱中取岀细胞板，弃去上清；再一次短暂涡漩TransFastTM TransfectionReagent/DNA 混合物，把混合物轻轻加入到细胞面上，注意不要直接吹到细胞面上，以免细胞脱落;轻轻混匀，使脂质体/DNA混合物覆盖细胞面，然后立即把细胞板放入二氧化碳培养箱中；温育1.0h后，轻轻加入1.0mL 37 C预热的完全生长液(或使血清浓度降到26% )，把细胞放入二氧化碳培养箱，37 C培养714d。LipofectamineTM

20、2000对293细胞的毒性要稍微大一点，但是转染效率相对也高一点。按照protocol做就可以，记得一定在转需要去掉培养基，否则毒性会更大。细胞 2-3天传代一次算是正常，我一般一瓶份 2瓶，2d就可以传代。转染后10-14天不换液有一部分可能会岀现死亡，但是大部分是没有问题的，如果细胞不好，肯定是维持不到这个时间的。细胞生长7天后就会非常密的。一定要有没有转染的细胞对照。转染后4-6h换液可以用维持液，血清浓度在 2-5%即可。腺搞毒是一种无包腮，呈20面体立体对称*线 形爰链DNA病奉，病議衣壳有252个壳粒，其中主 要是木邻体(hexa)在病再20面体的12个顶角 上，均有1个漬角壳粒，

21、因其与周围的5个壳粒相I 邻，®称为五邻体(pantun),五邻体的基底部伸出1 个纤维突起，其末端有一个球域，即bnh蛋白gJ 腺病®以其knob和柯萨奇腺病琏受体(CQXBadi-ie ad'eiiovirus receptor, CAR)i 结合，锚定在细胞表面 后.其五邻体基底部再与fi合索结合.ft合索作为辅 助分子介#T病旌肉吞逬人内涵休小泡“乙整个过 程中.kn站起着黏附病毒的作用.五邻体起了內化 病克的作用，它们各司其职，相互配合.两者对腺病 $的感染至关重要，本研究中，我们对其进行原核 表达.纯化krob蛋白并制&其单克隆抗体(mAb) F

22、 为下一步臊病毒的ffi向性改iS挺供试验基础.Reed-Muench法计算重组腺病毒的TCID50。重组腺病毒10倍比稀释（可以用维持液稀释，含2%血清）后接种293细胞，培养5d，观察CPE,结果如下（表3-1 ）。距离比=（高于50%的百分数-50% ） / （高于50%的百分数-低于50%的百分）(83.3%-50% ) / (83.3%-40% )=0.77LogTCID50=高于50%的病毒稀释度的对数 +距离比X稀释系数的对数 =7+0.77 X(- 1 )=7.77重组腺病毒的 TCID50为10 -8.77/mL。表3-1重组腺病毒各稀释度的CPE数able 3-1 Numb

23、ers of CPE of differe nt diluti ons of recomb inant ade no virus病毒稀释度接种孔数CPE+CPE-累积累积CPE- CPE+%S分比（）10坊440909/9100431515/6833l«-s422232/5401()94Ct4()70/7(t当转染的细胞出现特征病变（局部细胞变圆、脱落，成网状）或细胞状态不足以维持时，将细胞连同细胞板一起放在 -20度冰箱中冷冻，冻融后接种长满293A细胞的6孔细胞板，37 C吸附1.0h，每孔加入2.0mL维持液（含2%血清的DMEM ）,增殖病毒（反复冻融 3次,取上清，不用过滤

24、）。先大量增殖病毒，然后按照每次试验的需要量小量分装，测定病毒含量，病毒收获后可以添加 2%血清保存，最好-80 C保存，每次使用一管，完毕就处理掉,如每支100微升，即使使用5微升，下次也不再使用。在最佳的缓冲液（10mM Tris HCI pH8.0, 2 mM MgCI2, 4% sucrose )病毒会持续 1-2年稳定性。CPE（ytopathic effect）,细胞病变效应出现后，基本就能确定腺病毒包装成功。但还是要做鉴定，收毒后做免疫荧光，westernblot 等。7、病毒滴度测定TCID50 , Tissue culture infective dose 50，半数组织培养

25、感染剂量，又称50%组织细胞感染量，腺病毒感染性滴度，即指能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变(cyt op athiceffect, CPE）的病毒量。TCID50反映的是单位体积中的病毒量。准备细胞取出一块细胞培养板，每个孔大约传800010000个细胞（一个 T25瓶的细胞消化后加10ml培养液正好传一块 96孔板，要传匀）。每个孔的细胞大约 60 %丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。稀释待测病毒液。A法为参考书上标准的操作方法B法参

26、照书将液体量减少后的结果病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。A向每支试管中加入 1.8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液（10-1 , 10-210-10等），根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配 500 4,即10-1为50 4加入450 4的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100 4加入900 4孵育液中。若接种8个孔，则相应增加液体量。上述

27、的配液并不是固定不变的,可以根据接种的量自行调整。此步操作注意事项:1）建议每个稀释度接种 8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。2 ）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。3）此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。 接种取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次， 然后吸出孵育液（此步目的是去除血清， 因为血清能干扰病毒的吸附）。将稀释好的病毒液加到 96孔板上，每孔100 4，根据观察的习惯，一般从右到左，

28、从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1 , 10-2 ）到原液加样。（切记：设置正常的细胞对照）37 C CO2培养箱中孵育1h ,取出培养板吸去病毒液 （从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔） 加入维持液200 4继续在37 C CO2培养箱中培养。（也有地方介绍不去掉病毒液） 培养将培养板放置于 CO2培养箱。培养温度 ，培养几天。（一般4-5d ） 测定结果取出培养板，显微镜下观察细胞病变。 计算方法1） Reed-Mue nch法（常用） 观察CPE,找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按公式计算出该病毒液的TCID50。由表看出，能使50%细胞管出现病变的病毒稀释度在10-410

29、-5 之间，其中间距离比例按Reed和Muench 公式计算:TCID50 =高于50%病变的病毒最高稀释度的对数+距离比例故能使50%细胞管发生病变的病毒稀释度为10-4-5，即TCID50为104-5倍,当病毒悬液做104-5倍稀释时，0.1ml中含1个TCID50，作其他一些实验时（如中和试验），一般常用 100 TCID50/0.1ml 。2）判定标准细胞对照无病变，在无标准品时，应增加实验次数以减少误差。线性化过的腺病毒 DNA是只要转进细胞就能表达荧光，因为在我们转染过程中,转染次日就会看到有少量荧光的表达。腺病毒DNA虽然是线性的，但是表达原件是完整的,所以荧光是表达的。六孔板按

30、照5%接毒还是可以的，病毒滴度很高的话，可以再低一点，但是由于没有测滴度,可以使用这个量。 RT-PCR，比较容易做。可以在病变达到50%左右进行提取 RNA，这个好像要求不严格。如果大量细胞脱落，就要低速离心沉淀细胞再提。如果很少细胞脱落，去掉上请后，直接加 TRIZOL裂解即可。2、SDS-PAGE，你可以做一个时间梯度。比如病变30%、50%、80%、100%的时候取细胞，裂解后做 SDS-PAGE和western blot 。按照病毒生长周期，蛋白应该在晚后期表达。但是，由于接种量 MOI的关系，开始并不是每个细胞都感染了病毒。一些细胞感染之后,释放出病毒后再感染其他细胞，这样，整个过

31、程都在发生病毒的增殖周期。所以，我看文献讲，做SDS-PAGE鉴定，一般感染量要大，一开始，保证每个细胞都感染上病毒；而做病毒增殖，感染量要低。直接取上清或者一点细胞，量可能有点小。最好做一下浓缩。检测低限与蛋白量、一抗质量、 检测方法有一定关系。般CsCI离心可以起到浓缩和纯化的作用。如果你的条件达不到，可以不做。但是要保证你CsCI离心。60%到95%都有。一的病毒原始滴度可以用于试验。我以前做动物试验，测定免疫效果，也没有 转染条件看你使用的转染试剂的要求，不同的转染试剂要求不同，从 般的80-90% 都基本可以。腺病毒纯化包括3步:1 .不连续氯化铯密度梯度离心去除主要的细胞污染物 和

32、缺陷性病毒颗粒。2 .连续氯化铯密度梯度离心将感染性病毒颗粒和缺陷 性病毒颗粒分开。3. 透析去除氯化铯（去盐）。连续密度梯度需要过夜离心。为保证时间安排，建议从早上开始第1步，这样大约在午后就可开始过夜离心。按 照此时间安排，完整的一个纯化过程包括去盐在内大约 需2天时间。F面所有操作均以 SW28转子30ml离心管为例。理论上讲，溶液体积调整后也可用其它大小的离心管，切记在 离心后收集病毒带。由于有些污染物和成熟的病毒颗粒 密度相近，因此这二条带之间的距离很小。在大直径的 离心管中，病毒带更细，离原始位置更远，这样，病毒 带在30ml离心管中比在12ml的管中更易分辨。5.5.7不连续密度

33、梯度离心注意：为确保氯化铯密度梯度后较易分辨病毒带，扩增 病毒至少需要3 X 108细胞。1 . 预冷离心转子至4 C。2. 在离心管中缓慢加入8ml 1.4g/ml 氯化铯(53g+87ml 10mM Trz-HCL , PH 7.9 ),再非常轻缓 地加入 6ml 1.2g/ml 氯化铯 26.8+92ml10mMTris-HCL , PH 7.9 ）。病毒最终的纯度有赖于密度梯度的 质量。3.超净台中在不连续梯度顶部加入20ml DMEM5% 病 毒保存液，病毒量必须少于109细胞中所得的，否则将超 过密度梯度负荷量。如果保存液的体积少于 20ml，用PH 7.9 10mM Tris-HCL 调至 20ml。4. 平衡离心管，100000 X g （SW28转子上为23000rpw ) 4 C离心 90 分钟。5.超净台中取出离心管，用夹子直立固定离心管。用10ml移液器从梯度顶部吸去大部分杂质。在离心管外壁的穿刺点上贴上胶带，以防止在穿刺 过程中有液体泄露。8.用带18G针头的5ml注射器从离心管外壁稍低于病毒带（最下的一条带）的位置进行穿刺。 注意：感染性和缺陷性病毒颗粒之间的区域通常较浑浊, 切勿吸取这一浑浊区。小心抽吸病毒带，避免吸到其它带和杂质，拔出针头