在放射医学领域的应用蛋白质组学研究

1、在放射医学领域的应用蛋白质组学研究          随着人类基因组计划的实施和推进,生命科学研究已进入后基因组时代。在这个时代,生命科学的主要研究对象是功能基因组学,包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。蛋白质组学是生物技术的最新领域,它是继基因组学之后一个重要的研究重点。蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑,也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。2001 年的Science杂志已把蛋白质组学列为六大研究热点之一,蛋白质组学研究已成为21世纪生命科学与生物技术的重要战略前沿1

2、。（版权申明：本文由126论文发表网整理提供）      蛋白质组学研究的背景及进展      蛋白质组学概念的提出 1994年,澳大利亚Wilkins与Williams首先提出了蛋白质组的概念2。但相关研究可以追溯到上世纪90年代中期甚至更早,尤其是上世纪80 年代初,在基因组计划提出之前,就有人提出过类似的蛋白质组计划,当时称为人类蛋白质组计划, 旨在分析细胞内的所有蛋白质。但由于种种原因,这一计划被搁浅。90年代初期,各种技术比较成熟,在这样的背景下,经过各国科学家的讨论,才提出蛋白质组这

3、一概念。1995年7月首次出现在Electrophoresis杂志上。蛋白质组(Proteome)是指某一种细胞、组织或生物体的基因组在特定的时间和空间上所表达的全部蛋白质及其存在方式。以蛋白质组为研究对象,在整体水平上研究蛋白质的组成与调控活动规律的学科称为蛋白质组学3。      蛋白质组与基因组的关系每一个人类细胞中含有制造一个完整的人所需的全部信息。然而,并不是全部基因在所有细胞中都表达。编码细胞基本功能必需酶的基因在所有细胞中表达,而具有高度专一功能的基因只在特定类型的细胞中表达。因此,一种生物有一种基因组,但有许多蛋白质组。任何蛋白

4、质,即使只是同一个基因的产物,也可能存在多种形式。大多数蛋白质都以几种不同的修饰形式存在。这些修饰影响着蛋白质的结构、定位、功能和转换。因此,蛋白质组并不比基因组简单4。      蛋白质组的研究现状和发展趋势随着基因组计划的完成,蛋白质组研究已成为21世纪生命科学发展的先导,因而深受各国政府的关注。2001年,国际人类蛋白质组组织宣告成立。它积极倡导并推进“人类蛋白质组计划”, 得到众多国家的积极响应。2002年11月,在法国凡尔赛首届人类蛋白质组组织大会上,该组织宣布启动“人类血浆蛋白质组计划”和“人类肝脏蛋白质组计划”,这标志着“人类蛋白

5、质组计划”正式开始实施。目前,国际上蛋白质组研究进展十分迅速,不论基础理论还是技术方法,都在不断进步和完善。相当多种细胞的蛋白质组数据库已经建立。我国政府大力支持蛋白质组学研究。在人类蛋白质组计划中,我国在领导大型国际计划中首次实现了零的突破。由贺福初院士牵头的“人类肝脏蛋白质组计划”是第一个人类组织器官的蛋白组计划,目前有16个国家和地区的80余个实验室报名参加。 2002年初,由国家自然科学基金委员会和中国人民解放军总后勤部卫生部推荐立项的“973” 重大研究项目人类重大疾病的蛋白质组学研究正式全面启动。此后,科技部又投入11.2亿元全面启动了“中国人类肝脏蛋白质组计划”。该项研究的主要对

6、象就是严重威胁中国人健康的肝病,开展肝脏蛋白质组学研究对于肝病的预防、诊断、治疗都有重大意义。      蛋白质组学的研究内容及分类      蛋白质组学的研究内容主要包括以下几方面的内容:       (1)蛋白质鉴定利用一维电泳和二维电泳并结合蛋白质印记等技术,利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。      (2)翻译后修饰很多mRNA表达产生的蛋白质要经

7、历翻译后修饰如磷酸化,糖基化,酶原激活等才能表现出生物学活性。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式,因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。      (3)蛋白质功能确定包括分析酶活性和确定酶底物,细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析,利用基因敲除和反义核酸技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于对蛋白质功能的了解。 Clontech公司的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。     

8、0; (4)蛋白质之间的相互作用蛋白质之间存在着活跃、广泛的相互作用。即它需要与其他的分子相互作用才能完成其复杂的生理功能。这种相互作用不限于过去认识到的连锁反应或级联反应,它是一个复杂交错和具有精密调控的反应网络。蛋白质组学从多方位、多角度去研究蛋白质之间的相互作用和相互调控。只有通过对所有蛋白质的总和进行研究,即开展蛋白质组学研究,才能更加贴近地掌握生命的现象和本质,找到生命活动的规律5。具体方法可采用免疫沉淀或蛋白质亲和纯化的方法对与某种感兴趣的蛋白质相互作用的另一种蛋白质加以鉴定,也可以通过蛋白质芯片或酵母双杂交系统进行蛋白质相互作用的体外或体内检测6。  

9、0;   蛋白质组学研究类型根据不同的目的和采用不同的技术,蛋白质组学可以分为以下几种类型79:      (1)表达蛋白质组学:对于不同样品中的蛋白进行定量分析,以发现信号转导或与疾病相关的类型,称为表达蛋白质组学。      (2)结构蛋白质组学:研究细胞器等特殊细胞内部位的蛋白及蛋白复合体中的蛋白质分子结构的研究,称为结构蛋白质组学。主要任务是确定各种蛋白质的结构、亚细胞定位、结合蛋白等。      (3)功能蛋白质组学

10、:阐明生物体内的信号转导的机制、疾病发生的机制、以及蛋白-药物之间的相互作用等。蛋白质组学研究中的主要技术方法蛋白质组学研究中主要涉及的技术有蛋白的分离和鉴定、蛋白质结构研究、数据库的应用等方面。      双向凝胶电泳在蛋白质的分离鉴定中,双向凝胶电泳(2-D- PAGE)在蛋白质组分离中起到了关键作用。双向凝胶电泳是首先用等电聚焦电泳(IEF)根据蛋白质电荷进行分离,然后在垂直方向进行SDS- PAGE,根据蛋白质大小进行分离10。      生物质谱质谱(MS)技术是目前蛋白质组研究中发展

11、最快,也最具活力和潜力的技术。它通过测定蛋白质的质量来判别蛋白质的种类。20世纪80年代,蛋白质鉴定的常规方法为Edman降解法测N 端序列。该方法费用高、速度慢,限制了在蛋白质高通量研究中的应用。90年代后,生物质谱得到了迅猛发展。生物质谱根据软电离离子化技术的不同可分为:基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾电离质谱(ESI- MS)。前者可得到酶解肽段的分子量,获得肽质量指纹谱,然后通过检索数据库来鉴定蛋白质。后者是将消化后的多肽混合物用电喷雾法离子化后进入串联质谱,从获得的数据中解析出多肽序列信息,再通过数据库检索确定相应的蛋白质11。当前蛋白质组学研究

12、中最核心的技术就是双向凝胶电泳-质谱技术,即通过双向凝胶电泳将蛋白质分离,然后利用质谱对蛋白质逐一进行鉴定。       蛋白质组学在放射医学领域的应用及展望近两年来,蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域。在研究对象上,覆盖了原核微生物、真核微生物、植物和动物等范围,涉及到各种重要的生物学现象,如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等。在应用研究方面,蛋白质组学已成为寻找疾病分子标记和筛选药物作用靶点最有效的方法之一。在鉴定疫苗后选物、研究疾病不同阶段蛋白质变化,诊断和防治疾病等方面有着广泛的应用。蛋白质组学将对医学论文发表和生命科学

13、的各个学科的发展起到巨大的推动作用1。      蛋白质组学在放射医学研究方面取得的进展      (1)辐射致癌机理研究辐射可诱导细胞转化,是重要的致癌因素之一。辐射致癌有着特殊的作用特点,因此一直是放射生物学领域的研究热点13。由于辐射往往引起多基因而不是单基因的变化,它也不是单纯破坏机体的某一种调节机制,因而传统的生物化学方法和基因分析方法并不能完全胜任14。采用蛋白质组学技术,可以弥补上述不足,通过比较正常细胞与辐射诱导的各阶段转化细胞之间的蛋白表达差异,为研究提供新的标记和观察终点。

14、Prasad等15研究了人前列腺上皮细胞系在X 射线作用下的成瘤机制。在比较了267Bl、F3-SAC (锚地依赖性来源细胞系)、267B1-XR(源于30 Gy X射线的267B1)和267B1-SXR(源于30 Gy X射线的F3-SAC)4种细胞系的2DE蛋白质图谱后,发现在173-SAC蛋白表达图谱中,凝胶溶素表达缺失;在267B1-XR和267B1-SXR蛋白表达图谱上, 肌原肌球蛋白和肌浆肌球蛋白轻链-2表达分别呈进行性减少。 Gupta等16建立了辐射诱发皮肤横纹肌肉瘤的小鼠模型及其细胞系,通过2DE差异分析, 发现横纹肌肉瘤的细胞系可表达肌间线蛋白。这些工作,为进一步研究辐射诱

15、发肿瘤的机理提供了新的线索。左雅慧谢玲17、Ying等18进行了粒子辐射诱导人支气管上皮细胞系BEP2D的差异蛋白质组研究。经2DE蛋白质图谱及质谱分析,鉴定出了40个蛋白质点,获得了7个差异表达的蛋白质。这些差异表达蛋白质的发现,为进一步研究辐射诱导肺癌的发生机理,提供了蛋白质水平上的基础资料。      (2)肿瘤细胞的辐射效应研究电离辐射可造成DNA损伤、细胞周期调控紊乱和细胞死亡,这些效应是肿瘤放射治疗的基础。对于某些辐射高敏感性肿瘤来说,放射治疗是其临床治疗的重要手段。近年来,开始应用蛋白质组学方法研究肿瘤辐射效应及辐射敏感性的机理1

16、3。 Prasad等19研究了辐射诱导前列腺癌细胞凋亡过程中的蛋白质组变化,结果显示凋亡细胞中的丝蛋白、角蛋白-18、19、14-3-3等调控蛋白的表达下调,而葡萄糖代谢相关蛋白-94、钙网硬蛋白、钙连接素和蛋白硫化异构酶等的表达却显著增加。       (3)正常组织细胞辐射效应的研究 Gamble等20曾报道人肺上皮细胞和其他一些细胞系对小剂量电离辐射(<0.2 Gy)高度敏感,但是更高的剂量(0.40.6 Gy)却能激活细胞的保护性反应。采用2DE技术,发现0.5 Gy照射后4 h,蛋白质表达谱的变化最明显,有7种蛋白质出现25倍下调,一种蛋白质出现2倍上调。肽质量指纹分析表明,这些蛋白质分别归属于蛋白激酶C抑制剂、蛋白激酶C激活剂和凋亡过程中的细胞骨架蛋白,从而认为这些蛋白质可能均参与信号转导的过程。       (4)急性放射损伤的发病机理研究王治东等21采用蛋白质组学的双向电泳和蛋白质氨基酸序列分析技术研究了8 Gy射线照射后24 h后小鼠血清蛋白质的变化。结果发现血清中结合珠蛋白含量明显升高,预测该蛋白在辐射损伤中可能发