口腔上皮细胞论文用比较蛋白质组学技术筛选口腔黏膜上皮细胞体外

1、口腔上皮细胞论文：用比较蛋白质组学技术筛选口腔黏膜上皮细胞体外癌变的相关蛋白摘要目的：探讨口腔黏膜上皮细胞在体外癌变不同阶段表达的差异蛋白质。方法：以口腔黏膜上皮细胞体外癌变模型为对象，采用双向凝胶电泳技术和图像分析软件PDQuest分离和分析不同阶段细胞间的差异蛋白质点，采用LC-MS/MS质谱分析系统鉴定差异蛋白质点，采用Gene Ontology Annotation将已知差异蛋白质进行分类。结果：采用双向凝胶电泳技术和图像分析软件PDQuest，得到差异蛋白质点54个，采用LC-MS/MS质谱鉴定后，共得到候选差异蛋白质45个。根据Gene Ontology Annotation分类，

2、按细胞组成分布最多的差异蛋白质位于细胞质和细胞膜，按分子功能分布最多的是磷酸酶活性、催化活性、结构分子功能和钙离子结合功能，按生物过程分布最多的是代谢过程、细胞信号传导和细胞黏附与运动。结论：比较蛋白质组学方法中的双向凝胶电泳和质谱技术，能够很好分离和鉴定口腔黏膜上皮细胞体外癌变模型中不同阶段细胞的差异蛋白质。关键词口腔鳞癌；体外癌变细胞模型；比较蛋白质组学口腔鳞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，预后较差，5年生存率约为50%-60%1-2。随着生物标志物研究的深入，寻找具有临床诊断价值或预后判断价值的生物标志物，一直是研究的热点之一。而探索生物标志物在口腔鳞癌发生发展中的作用，也可为研究口腔鳞

3、癌发病机制和治疗靶标提供依据。蛋白质组学可以从整体角度研究细胞内动态变化的蛋白质成分、表达水平与修饰状态。目前最常用的蛋白质组学方法是比较蛋白质组学技术，主要是双向凝胶电泳和质谱2个核心技术的联合应用。本课题的前期研究成功建立了口腔黏膜上皮细胞体外癌变模型3-4，在此基础上，我们采用比较蛋白组学研究方法分析口腔黏膜上皮细胞在癌变不同阶段的差异蛋白质，为进一步的蛋白质功能研究奠定基础。1材料与方法1.1细胞培养采用本课题组前期建立的口腔黏膜上皮细胞体外癌变模型的3种主要细胞，即永生化口腔黏膜上皮细胞(HIOEC细胞)、苯并芘诱导HIOEC细胞产生的癌变早期阶段细胞(HB56细胞)和诱导产生的典型

4、鳞状细胞癌细胞(HB96细胞)。HIOEC细胞采用Defined keratinocyte-SFM培养液(Gibco，美国)，HB56和HB96细胞采用含10%胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)、1%谷酰胺和1%链霉素的DMEM培养液(Gibco，美国)，37、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养4。1.2细胞蛋白质提取L裂解液，冰上超声破碎细胞，离心12,000×g，90min。使用Bradford法(Bio-Rad protein Dye assay reagent，美国)进行蛋白定量。1.3双向凝胶电泳(two-dimensional gel elec-trop

5、horesis，2-DE)，设置等电聚焦程序(17，每根胶条的极限电流5070(A)：250V线性除盐30min，1000V快速除盐1h，10000V线性升压5h，10000V线性聚焦6 h，500V保持(17)。1.4银染与图像分析电泳胶采用固定液固定15min，增敏液增敏30min，MilliQ水漂洗3次，每次5min；银染20min；MilliQ水漂洗2次，每次1min；显色4min；加入终止液4min，终止反应10min。扫描银染凝胶(Bio-RadGS710 scanner，Bio-Rad，美国)，采用PDQuest软件分析图像，蛋白质点密度差异超过5倍者被认为具有统计学意义。1.5

6、质谱鉴定，还原30min；冷却后，用碘代乙酰胺取代DTT离心，暗处烷基化30min；碳酸氢铵洗胶、ACN脱水、离心、干燥各10min，加入110g胰酶，37酶解20h。收集酶解液，25mmol/L碳酸氢铵提取多肽，5%蚁酸、50%氰化甲烷提取3次，收集液体浓缩至20L，采用C18 Zip tips除盐。×150mm(RP-C18)，检测方式为正离子，进样方式为微型喷雾，毛细管温度为170，Trap柱为Zorbax 300SB-C18 peptide traps(AgilentTechnologies，美国)。1.9；当Charge+2，Xcorr2.2；当Charge+3，Xcorr

7、3.75；其中，Del-CN0.1。2结果2.1 2-DE分离、分析HIOEC、HB56和HB96细胞之间的差异蛋白质点双向凝胶电泳结束后，2-DE胶通过银染，可以较好地显示HIOEC、HB56和HB96细胞蛋白质点的分布情况(图1)。2.2筛选HIOEC、HB56和HB96细胞之间的差异蛋白质点采用PDQuest分析软件对HIOEC、HB56和HB96细胞之间进行两两比较，选择蛋白质丰度差异倍数在5倍以上的蛋白质点，并与原始2-DE胶进行比对，合并重复的蛋白质点，共得到用于进一步质谱分析的差异蛋白质点54个，其中位于HIOEC细胞2-DE胶的差异蛋白质点29个，位于HB56细胞2-DE胶的差

8、异蛋白质点3个，位于HB96细胞2-DE胶的差异蛋白质点22个(图2)。2.3差异蛋白质点的鉴定以1号差异蛋白质点为例，经过胶内酶解、收集、提取、浓缩和除盐后，采用LC-MS/MS鉴定肽段，其总离子流图(图3)提示具有相对高丰度的肽段，经过MS/MS分析，得到相应的肽段序列(图3)。将所有鉴定出的肽段序列，经过Bioworks软件搜索IPI hu-man蛋白质数据库，确定吻合率最高的蛋白质为候选差异蛋白质，即Calcyclin(S100A6)。其中，与Cal-cyclin蛋白质吻合的肽段数有14条，排除重复的肽段，独特性的肽段数有6条，这6条肽段与Calcyclin氨基酸序列(MACPLDQA

9、IGLLVAIFHKYSGKEGDKNTLSKKELKELIQKELTIGPKLQDADIAKLMDDLDRNKDQVVNFQEYVTFLGALALIYNDALKG，黑色横线部分为吻合的氨基酸序列组合)吻合率达到36.67%(表1)。最终的候选差异蛋白质汇总起来有45个。在45个差异蛋白质中，位于HIOEC细胞双向凝胶电泳胶中的差异蛋白质有26个，分别是CDNAFLJ40018 fis、clone STOMA2006398(Q8N849)、Cal-cyclin(S100A6)、Profilin 2(PFN2)、Thioredoxin-likeprotein 4A(TXNL4A)、S100 ca

10、lcium binding proteinA8(S100A8)、Interferon-induced 17 kDa protein pre-cursor(ISG15)、Acid phosphatase 1(ACP1)、40S ribo-somal protein S12(RPS12)、Lactoylglutathione lyase(GLO1)、Intermediate filament protein family protein(KRT7)、Superoxide dismutaseMn(SOD2)、Peroxire-doxin-1(PRDX1)、ETHE1 protein,mitochon

11、drial pre-cursor(ETHE1)、Prefoldin subunit 3(VBP1)、NADH-ubiquinone oxidoreductase 24 kDa subunit(NDUFV2)、Growth factor receptor-bound protein 2(GRB2)、Proteasome subunit beta type 3(PSMB3)、Triosephosphate isomerase(TPI1)、Ran-specific GT-Pase-activating protein(RANBP1)、Tumor protein D54(TPD52L2)、Delta3

12、,5-delta2,4-dienoyl-CoA isomerase(ECH1)、44 kDa protein-ENSP00000319797、Zyxin(ZYX)、Annexin I(ANXA1)、Nuclear protein Hcc-1(HCC1_HUMAN)和Poly(rC)-binding protein 2(PCBP2)；位于HB56细胞双向凝胶电泳胶中的差异蛋白质有3个，分别是Annexin A2(ANXA2)、Cofilin(CFL)和KRT17 protein(KRT17)，而位于HB96细胞双向凝胶电泳胶中的差异蛋白质有19个，分别是Galectin-1(LGALS1)、En

13、hancer of rudimentary ho-molog(ERH)、Profilin 2(PFN2)、Rribosomal proteinP2(RPP2)、Stathmin(STMN1)、Ran-specific GTPase-activating protein(RANBP1)、Cathepsin B(CTSB)、U-biquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1(UCHL1)、Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T)beta subunit 1(GNB1)、F-actin capp

14、ing pro-tein alpha-1 subunit(CAPZA1)、Mannose-6-phos-phate receptor-binding protein 1(M6PRBP1)、Maspinprecursor(SERPINB5)、LIM and SH3 domain protein1(LASP1)、Tubulin beta-2 chain(TUBB2C)、AnnexinA2(ANXA2)、Pyruvate dehydrogenase EI beta subunit(PDHB)、Elongation factor 2(EEF2)、Elongation factorTu,mitochon

15、drial precursor(TUFM)和Glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)。2.4鉴定蛋白质的分类根据蛋白质的功能，将以上鉴定出的已知差异蛋白质进行分类，采用的分类方法是GO注释(Gene O-tology Annotation)，主要分为3大类，分别与细胞组成(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物过程(biologic process)相关，具体分类结果见表2。3讨论比较蛋白质组学是生命科学蛋白组学中应用最为广泛的技术，它可用来研究疾病的发病机制，寻找疾病诊断、治疗和预

16、后的靶标。肿瘤细胞往往由正常细胞转变而来，在其转变过程中或者转变前后，某些蛋白质在表达数量、表达水平或修饰状态上会出现显著差异，导致或促进正常细胞向肿瘤细胞转变。比较蛋白质组学技术对于筛选差异蛋白质具有明显的优势，它不但可以比较出差异蛋白质，而且可能发现某些肿瘤相关的特异性生物标志物，作为肿瘤诊断的分子标记、肿瘤治疗和药物开发的靶点或判断肿瘤预后的生物标志物。比较蛋白质组学在口腔鳞癌方面的应用研究起步较晚，从细胞水平研究具有一定的优越性。细胞培养具有相对独立性，可以得到性质相同的纯化研究对象，避免间质成分的干扰；能够较好地体现肿瘤本身存在的异常，而且可重复性较好，生长速度可以控制，是肿瘤研究中

17、必不可少的环节。本课题组先前建立的国内首个口腔黏膜上皮细胞体外癌变模型，包括永生化上皮细胞(HIOEC)、苯并芘诱导产生的癌变早期阶段细胞(HB56)和诱导后产生的典型鳞状细胞癌细胞(HB96)3-4。基于此模型，我们应用比较蛋白质组学技术，比较口腔黏膜上皮细胞体外癌变过程中的差异蛋白质的表达情况，共鉴定出45个不同的差异蛋白质，其中24个差异蛋白质在HIOEC细胞中表达升高，2个差异蛋白质在HB56细胞中表达升高，16个差异蛋白质在HB96细胞中表达升高，另外3个差异蛋白质在2种细胞中都被鉴定出来，其中HB96和HB56细胞中都鉴定出来的差异蛋白质是Annexin A2(ANXA2)，在HI

18、OEC和HB96细胞中都鉴定出来的差异蛋白质是Profilin 2(PFN2)和Ran-specific GTPase-activating protein(RANBP1)。HB56和HB96细胞中表达都升高的差异蛋白质，可能与口腔黏膜上皮细胞的癌变存在一定的相关关系，而HIOEC和HB96细胞中表达都升高的差异蛋白质可能没有显著差异，但是也可能存在蛋白质修饰或降解引起的分子量和等电点差异。因此，需要对以上差异蛋白质做进一步验证研究。另外，根据蛋白质的功能，将其中的已知差异蛋白质采用GO注释(Gene Ontology Annotation)的分类方法，主要分为3大类，分别与细胞组成、分子功能

19、和生物过程相关。Gene Ontology(GO)是GeneOntology Consortium建立起来的数据库，旨在建立一个适用于各种物种、对基因和蛋白质功能进行限定和描述、并随着研究的不断深入而更新的语言词汇标准5。GO是多种生物学本体论语言中的一种，作为一种整合性分类系统，提供了3层结构的子层次，用于描述基因及其产物的功能，包括细胞组成、分子功能及生物过程6。而这3个子层次下面又可以独立出不同的亚层次，层层向下构成一个ontologies的树型分支结构。可以说，GO是生物学的统一化工具。GO最初是从3个模式生物数据库的整合开始：FlyBase7、Saccharomyces Genome

20、 Database8(SGD)和Mouse Genome Informatics9-10(MGI)，以后逐渐与其他数据库建立联系和链接，其定义法则也已经在多个合作的数据库中使用，包括SwissPROT、GenBank、EMBL、DDBJ、PIR、MIPS、SCOP和ENSYME等，这使得在这些数据库中的查询具有极高的一致性。GO注释往往在大量基因和蛋白质分类中被用到，并且可以得到有价值的信息，为进一步研究提供线索11-15。我们对45个差异蛋白质进行分类后，从细胞组成分类来看，这些差异蛋白质主要位于细胞质内，位于各个细胞器、细胞核和细胞膜的差异蛋白质较少。从分子功能分类来看，参与磷酸酶活性、催

21、化活性、脱氢酶活性、RNA处理、钙离子结合功能、结构分子功能、SH3/SH2结合活性、Mn超氧化物酶活性等的差异蛋白质都有。从生物过程分类来看，差异蛋白质主要参与细胞代谢、细胞信号传导、细胞凋亡、细胞黏附与运动、细胞转运、细胞发育、细胞骨架形成、细胞增殖和基因复制、转录和翻译等。通过GO注释，可以大致了解差异蛋白质参与了哪些细胞功能和生物过程，以及大致位于细胞的哪一部位，为深入研究提供线索。当然，正如目前所用的其他分子生物学技术一样，比较蛋白质组学技术也可能出现误差16。为了能够确切反映比较蛋白质组学结果，我们还需要对鉴定的差异蛋白质进行验证，包括细胞水平和组织水平，探讨它们在口腔鳞癌细胞和组

22、织中的差异表达情况，以及相应的临床应用价值。参考文献1Kademani D.Oral cancerJ.Mayo Clin Proc,2007,82:878-887.2Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002J.CA Cancer J Clin,2005,55:74-108.3Sdek P,Zhang ZY,Cao J,et al.Alteration of cell-cycle regulato-ry proteins in human oral epithelial cells immortalized by

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24、ogy:tool forthe unification of biology.The Gene Ontology ConsortiumJ.NatGenet,2000,25:25-29.6Harris MA,Clark J,Ireland A,et al.The Gene Ontology(GO)database and informatics resourceJ.Nucleic Acids Res,2004,32:D258-D261.7The FlyBase consortium.The FlyBase database of the DrosophilaGenome Projects and

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