结核分支杆菌利福平药物敏感性的直接快速检测

1、    结核分支杆菌利福平药物敏感性的直接快速检测        【摘要】目的探讨利用分子生物学方法直接快速检测临床标本结核分支杆菌利福平（RFP）药物敏感性的可行性。方法自行设计针对rpoB基因特异扩增的引物（扩增产物为183 bp片段），运用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）银染色法，检测45株结核分支杆菌临床分离株，对其中部分菌株进行rpoB基因DNA序列分析；运用PCR-SSCP银染色法对70份结核病患者痰标本进行直接快速检测，并与药敏试验结果做对照分析

2、。结果45株临床分离株中16株RFP敏感结核分支杆菌SSCP带谱与结核分支杆菌标准株（H37Rv）相同，29株RFP耐药株中有26株检测到突变谱，阳性率为90。从具有SSCP特征性带谱的菌株中筛选8株临床分离株进行rpoB基因序列分析显示：1株RFP敏感株无rpoB基因突变，7株耐药株均发生碱基突变（符合率100）。碱基以单点突变为主，以531位碱基突变最为多见4株531位TCGTTG，SerLeu（57）；1株531位TCGCAG，SerGln（14）；2株526位CACTAC，HisTyr（29）。与BACTEC对照临床痰标本直接快速检测阳性率为64。结论结核分支杆菌耐RFP是其rpoB基

3、因突变所致。PCR-SSCP银染色法可用于临床标本中结核分支杆菌RFP药物敏感性的直接快速检测。rpoB基因序列分析不仅证实了rpoB基因突变以531位及526位密码子的点突变为主，还进一步证实了PCR-SSCP银染色法的准确性。【关键词】分支杆菌，结核利福平药物耐受性聚合酶链反应多态现象，单链构象序列分析 Direct, rapid detection for rifampin susceptibility to M. tuberculosisYU Ying?, KANG Xixiong, JIN Ling, et al. ?Chang chun Worker's Medical C

4、ollege, Changchun 130051【Abstract】ObjectiveTo evaluate the use of molecular biotechnology for direct, rapid detection of rifampicin-resistance mutations in M.tuberculosis. Methods45 M.tuberculosis clinical isolates and 70 sputum samples were tested by polymerase chain reaction-single stranded confor

5、mation polymorphism （PCR-SSCP） technique. M.tuberculosis strain H37Rv was used as control and compared with the result of susceptibility test.DNA sequencing was also performed in some of the strains. ResultsAll tested susceptible isolates displayed identical SSCP patterns. Of 29 RFP resistance strai

6、ns, 26(90%) had distinct mobility shifts that can be discriminated from susceptible isolates. 9 sputum samples which were successfully evaluated by PCR-SSCP showed concordant result acquired from BACTEC 460 method.As the result of DNA sequencing,it was observed that seven RFP-resistance phenotype of

7、 M. tuberculosis strains had missense mutation,in which 5 isolates displayed TCGTTG or CAG mutations at codon 531,2 had CAC TAC mutation at codon 526. On the other hand, one strain which was susceptible to rifampin exhibited identical nucleotide alignment to the sequence of rpoB gene. ConclusionsPCR

8、-SSCP could be used as a method for simple,rapid,and reliable detection of rifampicin-resistance mutations in clinical samples of M.tuberculosis.【Key words】Mycobacterium tuberculosisRifampinDrug tolerencePolymerase chain reactionPolymorphism, single strand conformationSequence analysis结核分支杆菌对抗结核药物产生

9、耐受性，给结核病的防治工作带来威胁。对结核分支杆菌耐药分子机制的研究及对结核分支杆菌药物敏感性的早期快速诊断，是结核病防治工作的重要课题。近年来国内外学者对结核分支杆菌耐利福平(RFP)的分子机制的研究1-6,10,11表明，结核分支杆菌耐RFP是由于RFP靶分子RNA多聚酶亚单位的编码基因（rpoB）突变所致，且突变集中于rpoB基因508533位的76个氨基酸（78 bp）7组成的区域内，以531位丝氨酸替代最为常见。我们采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)银染色法对45株结核分支杆菌临床分离株进行rpoB基因突变的检测，并通过DNA测序法对其中部分菌株进行rpoB基因序列

10、分析，旨在证明PCR-SSCP银染色法的准确性。同时采用PCR-SSCP银染色法对70份结核病患者痰标本进行直接快速检测，对PCR-SSCP银染法的临床应用进行评估。材料与方法一、材料结核分支杆菌标准株及45株结核分支杆菌临床分离株获自北京市结核病胸部肿瘤研究所。痰标本为1997年11月1998年4月间在长春市结核病院住院的70例肺结核患者痰标本。二、方法1.细菌DNA的制备：临床分离菌株采用酚-氯仿提抽法提取DNA，置-20保存备用。临床痰标本的处理：40 g/L NaOH消化离心。沉渣经PBS冲冼，加裂解液，混匀，55孵育1小时，965分钟，16 000 rmin离心5分钟，取上清备用。2

11、.PCR扩增：根据文献8提供的序列资料，借助计算机辅助自行设计rpoB基因183bp片段（该片段包括了易发生耐药突变的78bp）扩增引物。上引物：5-AAGGAGTTCTTCGGCACCAG-3，下引物：5-GGTTTCGATCGGGCACATCC-3。PCR反应体系50 l包括：每个引物2.0 l，10 mmolL Tris HCl（pH 8.0），2.5 mmolL MgCl2，体积分数为0.10的丙三醇，dNTPs各2.5 mmolL，模板DNA 2.0 l，1.0 U的Taq DNA聚合酶。扩增反应共30个循环。3.SSCP分析：取扩增产物10 l置于80 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶中

12、电泳。1 g/L硝酸银染色，观察结果并摄像。4.DNA序列检测分析：在大连宝生物公司进行计算机识读结果。结果一、临床分离株PCR-SSCP结果45株临床分离株均获得183 bp扩增片段，说明扩增成功。以结核分支杆菌标准株H37Rv为对照，45株结核分支杆菌临床分离株中16株RFP敏感株SSCP带谱均与对照相同，29株RFP耐药株中有3株带谱与对照相同，另26株其SSCP带谱与对照有不同程度的差异。与药敏试验结果对照阳性率90，特异性100。二、DNA测序结果在45株临床分离株中选取8株，对其rpoB基因183 bp PCR扩增产物进行DNA序列测定分析，结果显示：5株耐RFP菌株碱基531位存

13、在点突变；2株耐RFP菌株碱基526位有点突变；1株RFP敏感株碱基序列无改变。详见表1。表18株结核分支杆菌临床分离株rpoB基因测序分析结果菌株RFP耐药表型PCR-DNA测序分析株数密码子*突变位点碱基置换氨基酸置换敏感1耐药531位TCGTTGSerLeu4TCGCAGSerGln1526位CACTACHisTyr2注：*号码与大肠杆菌rpoB基因位点相符三、临床痰标本PCR与BACTEC培养结果对70份临床痰标本的rpoB基因进行PCR扩增，结果有11份临床标本PCR扩增阳性。对该70份临床标本进行BACTEC460培养，结果显示14例呈阳性，PCR与BACTEC460对照结果详见表

14、2。 表2临床痰标本的rpoB基因PCR与BACTEC460培养结果BACTEC460培养PCR扩增合计+-+9514-25456合计115970四、临床痰标本BACTEC460药敏试验与SSCP分析结果14份BACTEC460培养阳性的临床痰标本，对其进行RFP药物敏感性试验结果显示，其中10份标本对RFP敏感。4份标本耐RFP。对该14份临床标本进行SSCP分析结果显示：5份标本呈现敏感型带 表3PCR-SSCP对14份BACTEC460培阳痰标本的评估PCR-SSCPBACTEC培阳合计RFP敏感RFP耐药阳性敏感型带谱505耐药型带谱044阴性505合计10414*注：*经BACTEC

15、种鉴定程序初定为结核分支杆菌谱，4份标本获得差异型带谱，阳性检出率64%。详见表3。 讨论抗结核药物RFP作用机制是，与RNA聚合酶亚单位结合进而影响转录过程。关键位点氨基酸改变可以导致RNA聚合酶结构发生变化而失去与RFP结合的位点，导致结核分支杆菌耐RFP。目前对结核分支杆菌编码RNA聚合酶亚单位基因rpoB的研究证实，RFP耐药株rpoB基因发生特定位点突变或基因缺失，突变集中在编码508533位的26个氨基酸（78 bp）区域内，并以531位突变最为常见，突变频率为51.5。其次是526位，突变频率为281。国内外对结核分支杆菌耐RFP基因突变检测的研究中，以PCR-SSCP方法报道居

16、多，此方法具有技术条件较为成熟、简单、快捷、准确及检出率高的特点。Telenti等9将此法与测序相对照，结果符合率达100。我们应用PCR-SSCP银染色法，对45株结核分支杆菌临床分离株进行耐药性评估，与药敏试验结果对照检出阳性率达90，与文献报道相符。我们对有PCR-SSCP特征性带谱的临床分离株进行rpoB基因测序分析，结果显示7例具有SSCP耐药型带谱的rpoB基因均有碱基突变，而敏感株无基因突变（符合率100），由此进一步证明了PCR-SSCP方法用于rpoB基因突变鉴别的准确性。我们对7株耐RFP结核分支杆菌rpoB基因测序结果显示突变高发位点是531位(71%)，与文献报道相符。

17、碱基置换以单点突变为主，未见缺失与插入突变。其中4株531位CT,SerLeu（57），1株531位TCCA,SerGln（14），同一密码子内双点突变（见表1），2株526位CT,HisTyr（29）。对70份临床痰标本中14份具有BACTEC培养及药敏试验结果的痰标本进行PCR-SSCP，结果表明（见表3）PCR-SSCP银染色法直接检测临床痰标本结核分支杆菌利福平药物敏感性，检出阳性率为64（914），如提高标本质量，加大标本用量，相信会进一步提高阳性检出率。70份痰标本中2份BACTEC460培阴PCR阳性痰标本，有待结合临床其它资料进一步分析。常规结核分支杆菌药敏试验需12个月时间，

18、不能满足临床早期开展有效治疗的需要。我们采用PCR-SSCP银染色法使结核分支杆菌RFP药敏试验在2天内即可完成，且经rpoB基因序列测定证实了方法的准确性。虽然PCR-SSCP方法不能精确判定突变的部位、性质和数目，却具有简便、快速、灵敏、准确地检测多个样本基因突变的优点。且我们采用自行设计的一对引物进行一次性扩增，不仅可以避免二次扩增可能带来的污染及错配现象，还降低了成本投入，简化了操作步骤，使检出阳性率同样达到90。故我们认为PCR-SSCP银染色法可用于临床标本结核分支杆菌RFP药物敏感性的直接快速检测，指导临床用药。志谢感谢北京结核病胸部肿瘤研究所程绍基博士及潘毓萱研究员的热诚帮助，

19、同时感谢长春市结核病医院提供的临床痰标本及其BACTEC460培养、药敏试验结果本课题为长春市科委攻关项目，受长春市卫生局基金资助作者单位：130051 长春职工医科大学(鱼瑛、王淑华)；白求恩医科大学第三临床医院(康熙雄、金玲)；白求恩医科大学微生物教研室(马琳)参考文献1Telenti A, Imboden P, Marchesi F, et al. Detection of rifampin-resistant mutations in Mycobacterium tuberculosis. Lancet,1993,341:647-650.2Kapur V, Li L, iordanes

20、eu S, et al. Characterization by automated DNA sequencing of mutations in the gene（rpoB）encoding the RNA subunit in rifampin resistant Mycobacterium tuberculosis strains from New York City and Texas. J Clin Microbiol,1994,32:1095-1098.3Williams D, Waguespack C, Eisenach K, et al. Characterization of

21、 rifampin resistance in pathogenic mycobacteria. Antimicrob Agents Chemother,1994,38:2380-2386.4吴雪琼，张俊仙，庄玉辉，等. 结核分支杆菌利福平耐药基因突变的研究. 中华结核和呼吸杂志，1998,21:329-332.5何秀云，庄玉辉，李国利，等. PCR-SSCP用于耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变的研究. 中华结核和呼吸杂志, 1996,19:338-341.6程绍基，严碧涯，马?, 等. 聚合酶链反应-冷单链构象多态性快速检测结核分支杆菌rpoB基因突变. 中华结核和呼吸杂志，1996,1

22、9:333-337.7Kim BJ,Kim SY,Park BH,et al,Mutations in the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis that interfere with PCR-single-strand conformation polymorphism analysis for rifampin susceptibility testing. J Clin Microbiol,1997,35:492-494.8Miller LP,Crawford JT, Shinnick TM. The rpoB gene of Mycobacterium