水稻是我国最主要的粮食作物之一但传统的淹水 -

1、NH4+对不同基因型水稻吸收NO3-的影响学生 司江英 学号01140 导师 封克扬州大学农学院 225009水稻是我国最主要的粮食作物之一，但传统的淹水栽培每亩耗水量可达400600立方米 (石元春，1997)，这对淡水资源缺乏的我国来说，无疑是限制农业可持续发展的一大障碍因素。此外，水稻对氮肥利用率的偏低（通常仅20 %- 40 %）又极易发生氮的淋洗和反硝化作用，前者造成地下水污染，后者引起臭氧层的破坏。因此，发展节水灌溉栽培技术和提高水稻对氮肥的利用率作为一种战略性的目标已成为农业科学家们的共识。水稻是生态适应性较强和水分生态幅度较宽的作物，其需水量超过旱作物主要由生态需水所致。也就是

2、说，在满足生理需水的前提下，节约生态需水是完全可能的。对此，八十年代我国就有人提出水稻旱作的概念（周毓衍 常锐1981；朱庭芸 1986）。最近，国内通过覆盖减少水分蒸发的水稻旱种研究工作又有新的进展（梁永超 等 1999）。然而，水稻一旦旱种，即意味着施入土壤的NH4-N肥在土壤通气得以大大改善的条件下会迅速转变为NO3，而NO3不能象NH4那样为土壤胶体所吸附，易被淋洗进入地下水或通过反硝化损失，还可能通过N2O破坏臭氧层。这样一来如何提高水稻对氮肥的利用率以及减少NO3-N对地下水的污染程度就更多地取决于水稻本身对NO3- 的吸收和利用能力这一焦点问题上。1 选题依据水稻对NH4+-N和

3、NO3-N都可吸收。但两种形态的氮都存在时，不同基因水稻表现出完全不同的吸收特点。对籼稻而言，NH4+-N的存在并不降低NO-3-N的吸收，甚至还有一定的促进作用。但NH4+-N却可以明显抑制粳稻对NO3-N的吸收（封克等，2000年）。为了选择在旱作条件下对NO3-吸收和利用能力强的水稻基因型，通过现代生物技术或杂交育种手段将有关特性转移到目标品种中去，以达到提高氮肥利用率减轻氮污染的目的。需要探讨在NH4+存在条件下，水稻对NO3-吸收和同化的机理及基因型差异。NO3-N的吸收包括三个阶段：第一，NO3-从质外体透过细胞膜进入根细胞的跨膜运输过程。第二，NO3-N还原过程（涉及到硝酸还原酶

4、）。第三，还原后的同化过程（此阶段与氨吸收后的同化过程相同）。显然NH4+-N对NO3-N吸收的影响可能存在前两过程，即跨膜吸收阶段和体内还原阶段。必须区分出是通过影响与跨膜运输有关的因子（如膜电位、膜结构、膜的去极化、载体对NO3-的亲和能力等）造成的；还是由于进入根细胞后，NH4+对硝酸还原酶（NR）直接抑制或通过同化产物再对NR造成反馈抑制造成；或是两者共同影响的结果。可用下图表示： NH4+ 膜结构改变？ N化合物膜电位改变？H+-ATP酶活性改变？硝酸还原酶活性改变？ 吸附位点亲和性改变？运转速度改变 NO3- 体内积累 NO3- 吸收受阻此外，就根的解剖结构而言，水稻根皮层中靠近表

5、皮有一层厚壁细胞（如图），这是水稻对湿生环境的适应性表现。这一层厚壁的机械组织保护着皮层的通气组织，防止根细胞中的氧径向散失到土壤中，保证氧向根尖输送，以此来满足水稻在厌氧条件下正常生长。然而，这一层厚壁细胞也可能阻碍养分的吸收。用离子选择电极实验证明，当用NH4+和NO3-同时提供给水稻时，在根尖1mm处NH4+吸收快于NO3-的吸收，在水稻根的基部地区，NH4+的吸收下降，而NO3-的吸收特点表现为在根尖的21mm处增加到最大值，继而也趋于下降，但总的趋势是NH4+的吸收快于NO3-，可见水稻皮层的这一层特殊的结构与氮的吸收可能有关。研究NH4+对不同基因型水稻吸收NO3-的影响，把这一环

6、节也归为机理研究的组成部分。目前，以不同基因型水稻为材料，将NH4+影响膜有关性质与NO3-跨膜吸收相联系的研究以及将水稻的解剖结构与NO3-的吸收相联系的研究都未有报道。开展此项研究具有重要的意义。 2 研究内容2.1 首先区分NH4+对不同基因型水稻利用NO3的影响主要是直接影响NO3的跨膜吸收过程，还是通过影响NO3在体内的还原过程从而进一步间接影响NO3的吸收。2.2 研究不同基因型水稻根细胞膜上H+ATP酶的活性。2.3 研究NH4+ 对不同水稻基因型根系吸收NO3的Km值和Vmax的影响；2.4 研究水稻根系皮层最外一层厚壁细胞对NO3-、NH4+吸收的影响及基因型差异（包括明显出

7、现厚壁细胞的时间及木质化程度）。3 研究方案3.1 试验材料 典型粳（武育粳） 典型籼（南特号） 籼杂（汕优63） 粳杂（泗优917）3.2 材料培养将四个供试水稻品种经1% NaClO3灭菌半小时后，于0.2mmol/LCaSO4溶液中浸泡24小时，进行催芽。播种分水培和旱作两种水分处理，旱作水分保持在最大田间持水量的50%，置于光温培养箱中，温度为280C，每日光照12小时，光强4000LX。水培光温控制如旱作，先将催芽后的种子铺于石英沙上（石英沙间用0.2mmol/LCaSO4溶液充满），生长至7天时，将幼苗转移至pH6.0的营养液中，水稻培养期间，每天用稀HCl和稀NaOH调节营养液的

8、pH值，每天自动通气2小时，每三天换一次营养液。3.3 试验方法判定NH4+在初始阶段是影响NO3的跨膜吸收，还是本身或其同化代谢产物通过影响NR活性等造成的反馈抑制。培养的水稻材料生长至18天时，转入无氮培养液培养2天，准备做吸收试验。设不同营养液处理，分别为： 对照（仅含15NO3） 添加NH4+（15NO3+NH4+） 添加特异性硝酸还原酶（NR）抑制剂（15NO3+NR抑制剂）；将水稻移至上述不同营养液中，吸收时间设为2、5、10、15、20、30、40、60、90、120分钟十个重复。测定： 叶片NR活性； 营养液中15NO3减少量； 根及地上部分15N分配情况。根据所得数据，可以明

9、确NH4+ 是否与特异性NR抑制剂一样直接对水稻根细胞内的硝酸还原酶活性有抑制作用；对不同基因型的影响程度有多大差异；如果对硝酸还原酶活性属于非直接影响，那么从接触NH4+ 开始至发生抑制作用一般需要多长时间。注：NR抑制剂采用M2WO4。利用钨可取代硝酸还原酶辅酶中的MO而使其丧失功能的特性。细胞膜H+ATP酶活性的比较培养的材料，苗龄20天左右；将根切下并用去离子水冲洗。然后切成小段，加入匀浆缓冲剂在低温下研磨。通过加入不同酶试剂。并经高速离心、过滤等处理后分离出微球形生物膜。再经过二相系统处理分离出细胞膜；利用钒酸盐（Na3VO4）抑制H+ATP酶活性的特点，设加与不加Na3VO4两个处

10、理。然后利用H+ 浓度不同会导致特定生化指示剂颜色深浅不同的性质，通过比色测定出H+ATP酶的泵H+ 能力，并计算出不同水稻基因型根细胞上H+ATP酶的特征参数Km和Vmax。测定不同水稻基因型吸收NO3的特征参数（Km、 Vmax）以及加入NH4+ 对这些参数的影响。培养的水稻材料生长至18天时，转入无氮培养液培养2天，用于测定根系对NO3吸收；吸收试验采用常规耗竭法。分析纯KNO3和0.2mmol/LCaSO4 溶液配制，NO3N浓度系列为0.05, 0.1 , 0.2, 0.4, 0.6, 1.0, 2.0 mmol/L，pH均为6.0。取生长均匀的健壮秧苗10株，将其根系全部插入50m

11、l的NO3N系列吸收液中吸收2小时，光温控制与培养时相同。取出秧苗，用吸水纸吸干根部水分，称取根鲜重。同时采用紫外分光光度法测定吸收液中NO3N的浓度。根据吸收前后NO3N浓度的变化量计算出单位鲜根单位时间内NO3N的净吸收量，即根系对NO3N的净吸收速率。采用Michaelis-Menten方程处理数据，求得吸收的动力学参数Vmax 和Km。 此外，测定NH4+对不同水稻基因型NO3吸收动力学的影响。吸收液用分析纯（NH4）2SO4、KNO3和0.2mmol/LCaSO4 溶液配制，吸收液中含1.0mmol/L的NH4+和不同浓度的NO3系列溶液（浓度如上），测定条件、测定方法与上述相同，同

12、样可求得NH4+影响下NO3吸收动力学参数Vmax 和Km。 研究不同基因型水稻根系皮层最外一层厚壁组织培养的材料生长至14天左右，开始测定；分别在距根尖1mm, 5mm, 7mm, 11mm, 21mm, 61mm处取横切面；制作半薄切片并拍照；比较不同基因型水稻明显出现这一层厚壁细胞的时间，随着根的生长，比较木质化的程度。结合其它影响因素，为研究NH4+对不同基因型水稻NO3-的吸收提供理论依据。4 部分研究进展 NH4+和NO3-共存时，水稻幼苗对NH4+的吸收速率明显快于对NO3-的吸收速率。对不同水稻亚种而言，NH4+NO3-吸收速率比存在明显的差异，粳稻幼苗是籼稻幼苗的两倍多。在N

13、H4+吸收上，粳稻比籼稻更具优势；在NO3-吸收上，籼稻比粳稻更具优势。NO3-对水稻幼苗NH4+吸收速率的影响较小，且品种间受影响的程度相差不大。NH4+对NO3-吸收的影响较大，且对于不同水稻亚种有不同的反应。NH4+能明显抑制粳稻幼苗对NO3-的吸收，而对籼稻幼苗NO3-吸收的影响较小，低浓度的NH4+（< 1.0 mmol /L）甚至能促进籼稻对NO3-的吸收。动力学研究表明， 水稻幼苗在NO3-吸收方面存在着明显的基因型差异。有NH4+存在时，不同品种在NO3-吸收方面的差异显得更为明显。籼稻比粳稻、杂交稻比常规稻、旱稻比水稻在NO3-吸收方面更具优势。这种优势更多地体现在根系吸收NO3-的最大速率（Vmax）上。NH4+并不影响水稻幼苗根系对NO3-的亲和性（Km的倒数），而只影响根系对NO3-的吸收速率。不同基因型水稻幼苗对NO3-的