副溶血性弧菌快速检测研究进展

1、 作者单位 :第一军医大学热带军队卫生学系微生物学教研室 , 广东 广州 510515 综述副溶血性弧菌快速检测研究进展 谭翰清 , 万成松 中图分类号 :Q939. 1 文献标识码 :A 文章编号 :1671-5039(2004 01-0021-03 副溶血性弧菌 (vibrio parahaemolyticus , Vp 是一 种嗜盐性细菌 , 属弧菌科 (Vibrio 弧菌属 , 主要存在 于近海岸的海水 、 海底沉积物和鱼类 、 虾类 、 贝类 、 牡 蛎等海产品中 。 人多因食用被本菌污染而又未煮熟 的海产品而引起中毒 , 在细菌性食物中毒中 , 比例 高 、 危害大 。 目前 ,

2、我国常规检测方法大多要经过前 增菌 、 选择性增菌 、 选择性培养 、 生化鉴定 、 神奈川现 象和血清学反应等过程 , 时 56d , 检出率低 ,疫 、, 近年 来世界发病率呈上升趋势 1。因此 , 建立 Vp 快速 、 准确 、 特异 、 灵敏的检测诊断方法是十分必要的 。 下 面对副溶血性弧菌快速检测方法的研究进展进行综 述 。1 KP 溶血试验副溶血性弧菌临床分离株绝大部分都能产生耐 热直接溶血毒素 (therm ostable direct hem olysin ,T DH , 并能在我萋血平板上产生一种特殊的溶血现象 , 叫 做神奈川现象 (kanawaga phenomenen

3、 , K P 2。该试 验需经过前增菌 、 选择性增菌 、 选择性培养后 , 挑取 可疑菌落接种到我萋血平板上 , 置于 37 孵箱中过 夜 , 如菌苔周围出现透明溶血环 , 即为 K P 阳性 , 据 此诊断样本中含有 Vp 。该试验是检测副溶血性弧 菌最基本的方法 , 能把绝大部分副溶血性弧菌检测 出来 , 但操作繁琐 、 所需时间长 (约 4d , 而且存在部 分 T DH -株 , 易漏检 , 给人们健康带来危害 。2 免疫学方法免疫学方法特异性强、 灵敏度高 、 易于观察 、 应 用广泛 。 血清学反应是最基本的免疫学反应 , 主要 用于细菌分型 。目前 , 通过血清学反应 , Vp

4、 可分为 13种 O 血清型 、 71种 K 血清型 3。正确的分型为 流行病学调查和临床用药提供依据 。 但此反应只能 大概区分不同地区和来源的菌株 , 而且由于抗原位 点受环境等因素的影响易发生突变 , 出现新的血清 型时 4, 以现有的血清检测就会漏检 。目前 , 应用最广泛的免疫学方法是酶联免疫吸 附法 (enzyme linked immunos orbent assay , E LIS A 。该, , 特异性好 , 灵敏Vp 临床分离株大多为 T DH +株 ,TRH (ther 2 m ostable related hem olysin 阳性株只占 10%15%, 少数为 T

5、DH 和 TRH 双阳性 , 环境分离株几乎无 T DH +5,6, 所以大多研究者主要选择 T DH 、 TRH 为 抗原 , 制备相应的抗体进行检测 。E LIS A 抗体的包被与固定是关键 , 影响检测的 灵敏度和特异性 。 H onda 等 7设计了一种新的固定 方法 , 用 HCl 、 聚乙烯 (polythylence imine , PEI 、 甲基 乙烯基马来酸酐聚合醚 (malwic anhydride methylvinyl ether copolymer ,MAMEC 等化学试剂处理尼龙膜 , 接 着固定包被 T DH 和 TRH 的单克隆抗体 , 然后与 Vp 培养肉汤

6、中 T DH 或 TRH 反应 15min , 洗涤后 , 与抗 T DH 、 TRH 的兔血清多克隆抗体 37 反应 15min , 再 与碱性磷酸酶标记的抗兔抗体 IgG 反应 , 最后底物 显色 。 结果显示 , 经过紧密相连的三次抗原抗体反 应 , 特异性 100%, 灵敏度 9515%, 并且通过肉眼观 察就能区分 T DH 和 TRH 株 。同时 , 该尼龙膜也可 以直接用于检测粪便标本 , 特异性达 8819%, 灵敏 度达 92%, 并能在 1h 内完成检测 。此固定方法减 少非特异性吸附 , 增强抗体结合度 , 从而增强了特异 性 , 提高了灵敏度 。但是 , 这种方法涉及到

7、抗体包 被 、 固定 、 抗体的标记 、 显色等步骤 , 操作繁琐 , 技术 要求高 , 而且尼龙膜不能长期保存 , 不能进行大规模 临床检测 。 同时 , 直接检测时 , 抗原量可能不足 , 抗 原位点也容易改变 , 导致出现新的血清型 , 如近年来 出现新的 O3 K 6血清型 8, 最终造成漏检 。 1 2 3 核酸杂交免疫学方法是在蛋白水平检测 Vp , 而核酸杂交 则是在基因水平进行检测 , 结果更为特异 、 准确 、 可 靠 。 用于检测 Vp 的核酸杂交方法主要有斑点杂 交 、 S outhern 杂交 、 夹心法杂交 。311 斑点杂交 1992年 , Y amam oto 等

8、 9针 对 tdh 和 trh101 125bp 的基因设计探针 , 对 Vp 进行斑点杂交检测 , 其中 tdh 探针基因序列为 5 2ccccggttctgaX gagatattgtt 2 3 , trh 探针基因序 列 为 :5 2tccaggttcggaX gagctactatt 2 3 ,X 为 dUTP , 用于标记碱性磷酸酶 。他们将 Vp 临 床分离株的克隆基因片段点到尼龙膜 , 与探针在 50 杂交 10min , 洗涤 , 最后底物显色 。结果显示 , tdh 探针特异性为 100%、 灵敏度为 93%;trh 探针特 异性为 93%、 灵敏度为 86%。 但是 ,tdh

9、探针把部分 弧菌科的其他细菌也检测出来 , 造成一定的假阳性 , 而且膜上核酸片段易脱落 , 不能长期保存 。312 Southern 杂交 1998年 ,Suthienkul 等 6株进 行 S KYEcoRI 片段 , 长 p KY 298的 EcoRI 片段 , 长 334bp , dUTP 都标记上地高辛 。 他们将菌株的 DNA 片段 Hind 酶切 、 电泳 、 尼龙膜 转移后 , 与 tdh 、 trh 探针杂交 , 然后与碱性磷酸酶标 记的抗地高辛抗体反应 , 最后底物显色 。 结果显示 , tdh 和 trh 探针特异性好 , 把 tdh +株 (共 127株 和 trh +

10、株 (共 37株 全部检测出来 。然而 , 这种方法操 作繁琐 、 时间长 , 不适合临床实验室的快速检测 。 313 夹心法杂交 2003年 ,Lee 等 10采用夹心杂交法检测海产品 中 Vp 的 tl 基因 。 他们对微孔板进行 NH 修饰 , 然后 与 tl 基因捕获探针的磷酸基团共价结合 , 接着把 PCR 变性产物 、 标记生物素的信号探针加到微孔板 中进行杂交反应 , 洗涤后 , 与酶标链亲和素结合 , 最 后底物显色并在 405nm 紫外灯下检测 。结果显示 , 该方法检测信噪比在 14114312之间 , 特异性好 , 灵敏度高 , 能把每克牡蛎组织里 10个 Vp 检测出来

11、 。 该方法易于制成试剂盒 , 目前 , 美国市场上已有销 售 。 由于试剂盒已经把捕获探针固定在微孔板上 , 检测时只需把 PCR 产物加到微孔板中杂交就行了 , 操作简单 , 重复性好 , 灵敏度高 , 特异性好 , 能进行临 床大规模的快速检测 , 并且易于在普通实验室推广 。4 PCR近年来 , 随着微生物基因组学的发展 , 微生物基 因检测迎来了新的机遇 。 2000年 ,Makino 等 11已经 完成 Vp 的基因组测序 , Vp 毒力基因及特异的基因 序列得到进一步确定 。根据 Vp 特异基因序列 , 设 计引物 , 进行 PCR 检测 , 是现阶段检测 Vp 的最快速 准确的

12、方法 。 目前应用于检测 Vp 的 PCR 方法主要 有任意引物 PCR (abritrarily primed PCR ,Ap 2PCR 、 针 对任意 引 物 PCR 、 多 重 PCR (multiplex 2PCR 、 实 时 PCR (real 2time PCR 。411 任意引物 PCRMatsum oto 等 12采用任意引物 PCR 对 Vp 进行 检测 。 他们针对 Vp 的 tdh 和 trh 基因一段特异的序 列 , 设计两条引物 , 引物 1:5 2ggtgcgggaa 23 和引物 2: 5 2gtttcgctcc 23 , 对 19771998年所收集的 227株

13、 Vp 进行 PCR 。 通过电泳分析发现 ,19961998年收集 的 22株血清型为 03 K 6菌株与 1996年以前收集的 O3 K 6, 为 O3 K 6血 清型新出现的变异株 , 。这 。tdh 基因 , 因此 绝大部分研究者都根据 tdh 设计引物进行特异扩 增 。 1993年 ,Lee 等 13根据 tdh 基因设计引物 , 对 36株 T DH +株 、 89株 T DH -株以及 46株其他弧菌和肠 道菌进行 PCR 检测 。结果显示 ,36株 T DH +株全部 特异扩增出来 , 其余菌株都没有扩增 ; 而检测灵敏度 高 , 最低检测量可至 40pg DNA , 并可直接

14、检测粪便 标本 , 无需分离培养 , 方便快速 。1999年 ,K im 等 14选择 toxR 基因序列设计两对 引物 ,5 2gtcttctgacgcaatcgttg 23 和 5 2atacgagtggttgctgtcatg 2 3 , 对 14株 Vp 、 14株其他弧菌进行 PCR 。 结果显示 , 14株 Vp 都得到一条 368bp 的特异扩增亮带 , 而其他 菌株没有特异扩增。 此外 ,Venkateswaran 等 15选择 gyrB 基因设计引物对 Vp 进行 PCR 、 C ordova 等 16选择 pR72H 基因设计引物进行 PCR , 特异性、 灵敏度都很 好。4

15、13 多重 PCR由于不是全部副溶血性弧菌都含 tdh 或 trh 基 因 , 所以只针对 tdh 或 trh 的单一 PCR , 有时会漏检 。 多重 PCR (multiplex 2PCR 能全方面高效率地检测 Vp 。 1994年 ,Bej 等 5针对 tl 、 tdh 、 trh 设计不同的引 物对 , 在同一 PCR 反应体系内同时扩增 tl 、 tdh 、 trh 。 结果显示 , 所有的 Vp 都扩增出 tl 基因 ,tl 基因是 Vp 特异的 ;54%的 Vp 扩增出 tdh 基因 ; 只有 38173%的 Vp 扩增出 trh 基因 ; 该法灵敏度高 , 能把 10g 牡蛎培

16、 养肉汤里 10100个 Vp 检测出来 。与其他常规生 化方法相比 , 多重 PCR 更快速 、 仅 8h 就能完成检 2 2 测 , 结果更为准确 、 可靠 , 而且还可改进成定量竞争 PCR , 对标本中靶序列进行定量 。414 实时 PCR常规 PCR 检测 , 需要从反应体系中吸取产物做 电泳或 S outhern 杂交等实验进行鉴定 , 转移过程中 易污染 , 造成假阳性 , 而且耗费时间 。 1996年 ,T yagi 开创了一种实时 PCR (real 2time PCR 。实时 PCR 是 在 PCR 反应体系中加入标记有报告基团和猝灭基 团的线性 T aqman 探针或茎环

17、型荧光分子信标探针 , 在基因扩增过程中 , 与产物杂交 , 此时 , 报告基团和 猝灭基团距离分开 , 根据能量共振转移现象 , 报告基 团发出荧光而被检测 。这种方法操作简单 , 闭管检 测 , 减少污染 , 灵敏度高 , 并且可以在 PCR 结束或 PCR 过程进行同步定性或定量检测 , 而且可以进行 临床大规模快速检测 。2003年 ,Blackstone 等 17针对 tdh 设计荧光分子 信标探针 , 对从牡蛎中富集的 13个不同种类的菌株 进行实时 PCR 检测 。 结果显示 , 只有含 tdh 的 Vp 才 被检测出来 , 特异性好 , 灵敏度高 ,体系的 1个 CFU 检测出

18、来确 ,探针 ,PCR 自 1996展 , 相信随着经济的发展 、 技术的进步 、 实时荧光检 测仪的普及 , 将会得到更为广泛的应用 。5 展望随着微生物基因组学、 现代分子生物学理论与 技术的发展以及新仪器研发 , 副溶血性弧菌的检测 方法必将向快速 、 准确 、 灵敏 、 特异的方向发展 , 特别 是 PCR 、 核酸杂交 、 E LIS A 这三大现代分子生物学技 术的联用以及实时 PCR 的进一步完善 , 将会实现副 溶血弧菌快速 、 准确 、 灵敏 、 特异 、 大规模的检测诊 断 , 大大提高食品检验检疫和临床诊断的检测质量 和效率 。参考文献 :1 G ooch JA ,Dep

19、aolar A ,K aysmer CA et al. Evaluation of tw o direc plat 2 ing methods using nonoradio active probes for enumeration of vibrio parahaemolyticus in oystersJ.Appl and Environ M icrobiol ,2001,67 (2 :721-724.2 Okuda J , Nishibuchi M. M anifestation of the kanagawa phenomenon , the virulence 2ass ociat

20、ed phenotype , of vibrio parahaemolyticus depends on a particular single base change in the prom oter of the therm ostable direct haem olysingeneJ.M ol M icrobiol ,1998,30(3 :499-511. 3 Iguchi T , K ond o S , H isatsune K . Vibrio parahaemolyticus oseroty pe from O1to O13all polym erase r 2ty pe :SD

21、S 2P AG E and com positional sugar anal 2ysisJ.FE M S M icrobiol Lett , 1995, 130(223 :287-292.4 M yers M L , Panicker G,Bej AK. PCR detection of a newly emerged pandem ic vibrio parahaemolyticus 03:06pathogen in pure cultures and seeded waters from the gulf of mexico J.Appl Environ M icrobiol , 200

22、3,69(4 :2194-2200.5 Bej AK, Patters on DP , Brasher CW , et al. Detection of total and hem olysin 2producing vibrio parahaemolyticus in shellfish using multi 2 plex PCR am plification of tl ,tdh and trh J.J M icrobiol M ethods , 1999,36(3 :215-225.6 Suthienkul O , Iida T , Park K S ,et al. Restricti

23、on fragment length poly 2 m orph 2ism of the tdh and trh genes in clinical vibrio parahaemolyticus strainsJ.J Clin M icrobiol , 1996,34(5 :1293-1295.7 H onda T ,M iwatani T ,Y abushita Y,et al. A novel method to chem ically imm obilize antibody on nylon and its application to the rapid and differ 2

24、ential detection of tw o vibrio patahaemolyticus toxins in a. m odified en 2 zyme 2linked immunos orbent assayJ.Clinical and diagnostic laborato 2 ry immunology ,1995,2(2 :177-181.8 Okuda J ,Ishibashi M ,Hayakawa E , et al. Emergence of a unique O3: K 6clone of vibrio parahaemolyticus in Calcutta. I

25、ndia , and is olation of strains the same clonal Asian travelers arriv 2 in .J (12 :3150-3155. 9H onda , M Enzyme 2labeled olig onu 2 of the genes for therm ostable direct olysin (T DH and T DH 2related hem olysin (TRH of vibrio para 2 haemolyticus J.Can J M icrobiol , 1992,38(5 :410-416.10 Lee CY,

26、Panicker G, Bej AK. Detection of pathogenic bacteria in shellfish using multiplex PCR followed by covalink NH m icrowell plate sandwich hybridezationJ.J M icrobiol M ethoeds , 2003,53(2 :199 -209.11 M akino K,Oshima K,K urokawa K, et al. G enome sequence of vibrio parahaemolyticus :apathogenic metha

27、nism distinct from that of vibrio choleraeJ.Lancet ,2003,361(9359 :743-749.12 M atsum oto C , Okuda J , Ishibashi M ,et al. Pandem ic spread of an O3:K 6clone of vibrio parahaemolyticus and emergence of related strains evidenced by arbitrarily primed PCR and toxRS sequence anal 2 ysesJ.J Clin M icrobio ,2000,38(2 :578-585.13 Lee C ,Pan SF. Rapid and specific detection of the therm ostable direct haem olusin gene in vibrio parahaemolyticu