动物生物反应器

1、动物乳腺生物反应器的现状和趋势学院：化工学院班级：生物2012姓名：韩沛志学号：120123302042动物乳腺生物反应器的现状和趋势韩沛志（辽宁科技大学化工学院生物工程，辽宁鞍山 114051）【摘要】动物乳腺生物反应器技术是转基因技术的应用，于上世纪80年代提出，其目的是利用动物乳腺产生目的蛋白。利用该技术生产的蛋白具有低成本，高活性，易提取纯化的优点。虽然该技术尚处于发展时期，但具有广阔的应用前景和巨大地商业潜力，是许多公司大力发展的对象。文章综述了转基因动物乳腺生物反应器的原理、制备技术及应用、优点、国内外研究进展及存在问题，并对其发展方向进行了展望。【关键词】 转基因动物，乳腺，生物

2、反应器乳腺生物反应器是基于转基因技术平台，将外源基因导人动物基因组中并定位表达于动物乳腺，利用动物乳腺能够天然、高效合成并分泌蛋白质的能力，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值的蛋白质的转基因动物的总称。1987年美国科学家Gordon等人首次在小鼠的乳汁中表达出人的蛋白tPA(组织型纤维蛋白溶酶原激活因子)，展示了用动物乳腺生产高附加值产品的可能性。此后十多年的科学实践证明，动物乳腺有广泛表达外源基因的能力，可以生产各种蛋白质和多肽，从小分子肽到大分子蛋白质，从分泌型蛋白到内膜蛋白、多聚蛋白、二价抗体等。显示动物乳腺是一种很好的生物反应器，在生产高附加值蛋白质方面有广泛用途。现己成为生物技术研

3、究的热点。并向商业化阶段转变，显示了广阔的应用前景。并且利用转基因动物乳腺生物反应器生产饮用奶，以期望获得既能满足蛋白质需要，又能增加抵抗力的品质全面的奶，为人类服务【1】。1、乳腺反应器的原理乳腺生物反应器(Gland Bioreactor)技术是指利用乳腺特异表达的乳蛋白基因的调控序列构建表达载体，制作转基因动物， 指导外源基因在动物乳腺中特异性、高效率地表达， 以期从转基因动物乳汁中源源不断地获得外源活性蛋白。乳腺生物反应器的原理是应用重组DNA 技术和转基因技术，将目的基因转移到尚处于原核阶段的动物胚胎中经胚胎移植得到转基因乳腺表达的个体。外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启

4、动子和调控区【2】 即需要一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列，这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下，使其在乳腺中表达再通过回收奶获得具有生物活性的目的蛋白。它是一个专门化的分泌腺体，可以生产出具完全生物活性的药用重组蛋白质，其纯化简单，生产投资及成本相对较少，而且对环境不具污染性，也被称为“分子农场”。2、动物乳腺生物反应器的主要研究内容2.1 乳腺特异表达载体的构建乳腺特异表达载体就是能够在动物的乳腺部位特异表达携带外源目的基因的DNA片段。目前已克隆并用作构建载体的乳蛋白基因主要有-乳球蛋白（BLG）基因、s1-酪蛋白基因、酪蛋白基因、乳清酸蛋白（WAP）以及乳清蛋白基因。乳腺

5、特异表达载体的首先要具备乳腺特异的启动子，目前所熟知的乳腺特异启动子有Beta-乳球蛋白基因的启动子，S1 /Beta 酪蛋白启动子( S1 /Beta Casein，CA) ，乳清酸蛋白基因启动子，其中研究最多和效果较佳的是绵羊的BLG、牛的S1CA、山羊的Beta-CA、小鼠的WAP 等基因的启动子如果得用目的基因的DNA序列而不是cDNA,表达效果可能会更好。不翻译的外显子和内含子的掺入可能有利于转基因的表达【3】。2. 2 乳腺生物反应器的基因介导方法【4】1)微注射法微注射法是指直接将裸露的线形DNA直接注射到胚胎原核中，使得目的DNA整合到宿主基因组上。这种方法基因整合效率低，在家

6、畜中尤其如此，家兔和猪为5%15%，山羊2%，绵羊1%5%，而牛不超过05%，而且成本高;基因只能加入，不能剔除或原位修饰;整合是随机的，由于插人位点的关系，转基因的表达不确定;随机整合可能破坏重要的内源性DNA序列或激活细胞的致癌基因;产生的转基因动物常常是嵌合体，即并非所有细胞都整合有外源基因;以及不能在胚胎早期确定性别等。2)精子载体法该方法实验的重复性很差，且DNA整合进基因组后，基因重排现象严重。然而，最近有研究显示，通过体外受精或人工授精的方法，目的DNA与抗精子表面蛋白的抗体结合，能有效进入受精卵中，这个方法目前已经成功地生产出转基因小鼠与猪，外源基因以这种途径进入动物体内整合效

7、率高，没有基因重排现象，能表达且能传递给子代这种方法似乎又给精子作为载体的转基因方法带来的曙光。3)逆转录病毒法将外源基因替换病毒基因组的gag，pol和env等基因，通过顺式元件的调控序列和感染成分重组病毒载体，然后注射到第二次减数分裂中期的卵母细胞，体外受精和筛选后，将胚胎移人假孕母体的子宫内，继续发育成转基因动物。该方法整合稳定，拷贝数和插入位点相对固定，转基因效率高。然而转录病毒载体容量有限，只能转移小于10kb片段的DNA，而且基因是随机插入的，由于多处整合而产生嵌合体;虽然设计时缺失复制功能序列，但复制大量载体所需的辅助病毒基因组也可能与目的基因一起整合到同一细胞核中，有可能产生辅

8、助病毒株，从而产生生物安全性问题。23转基因动物模型的建立【5】表达产物是否有生物活性、对动物生长发育是否有副作用及其表达水平能否达到商业化生产的需求等，是衡量乳腺生物反应器是否成功的重要标准，因此需要动物模型来检测效果。制作转基因动物模型时要考虑研究周期、可操作性、成功率、成本及风险等诸多因素，跟其他动物相比，小鼠是最理想的动物模型，它成本低、研究周期短、可操作性强，因此大部分研究者将小鼠作为动物实验模型。1987年，Gordon等构建了由小鼠WAP基因启动区驱动的人组织纤溶酶原激活剂(t-PA)重组表达载体，首建乳腺生物反应器小鼠模型。3、动物乳腺生物反应器的研究现状及进展国际上，动物乳腺

9、生物反应器中某些产品的研发比较顺利，从1987年gordon等人在转基因小鼠乳汁中表达出人的tpa，之后的20年里，已有数百种产品在小鼠乳腺中获得了高效表达，数种重要医用产品已在大动物乳汁中被生产出来。如上世纪90年代美英等国从转基因山羊获得的抗凝血酶【6】，从转基因绵羊得到的al一抗胰蛋白酶、人凝血因子 ，从转基因牛获得的乳白蛋白、乳铁蛋白，还有来自转基因兔的 一葡萄糖苷酶等。目前，全球有十几家公司在开展动物乳腺生物反应器的产业化开发。比如英国的PPL公司、荷兰的Pharming以及美国最大的生物技术公司GenzymeTransgenics Corporation是三个比较出色的公司。它们在

10、很多药物开发，市场和产业化方面投入了大量资金，到目前，至少已有2种药物完成了临床试验，5种进入临床三期试验，37种进入了二期临床研究阶段。现在，有十几个国家也在进行相应的工作，像美国、英国、荷兰、加拿大、法国等。在我国，施履吉院士【7】早在2O世纪80年代初就提出乳腺生物反应器构想，并获得了表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔；20世纪90年代，国家“863”高技术计划将乳腺生物反应器的研究列入重点科研项目；1995年，我国首次在小鼠乳腺中成功地表达了人的基因；1996年，上海医学遗传研究所与复旦大学合作，成功培育出5只转基因羊，并在乳汁中提取出了具有生物活性的人凝血因子IX；“九五”期间，我国首次

11、培育出了高水平表达的转基因绵羊；2001年，又成功获得了5只携带鸡法氏囊疫苗基因的羊，其表达水平基本达到了产业化生产标准； 2005年，国家“863”计划组利用转基因体细胞克隆技术，分别获得了转人乳铁蛋白、转人溶菌酶、转乳清白蛋白、转人岩藻糖转移酶等转入基因蛋白；其中“人乳铁蛋白”和“人 一乳清白蛋白”是在国际上首次利用转基因克隆牛而获得。现在，我国已有4种基因工程药物或疫苗在上海、长春、深圳等地生产并投放市场，另有十余种已进人中试阶段。4、乳腺生物反应器的应用4.1 生产基因工程药物由于乳腺固有的优越性使之成为生产药用蛋白的工厂。据美国红十字学会和美国遗传学会预测，到2010年所有基因工程药

12、中，利用乳腺生物反应器和营养保健蛋白。这些蛋白可为免疫系统功能不全的人和接受放、化疗的病人的辅助治疗提供优良制品。目前通过转基因动物乳腺生物反应器生产的主要生物制品有人乳铁蛋白、人组织型纤溶酶原激活因子(http)、新生血管抑制因子、人血白蛋白等。4.2 改变乳汁成分。提高营养价值利用转基因动物乳腺生物反应器生产饮用乳品的目的是期望获得既能满足蛋白需要又能增加抵抗力的品质全面的奶，为人类服务。如导人乳铁蛋白基因以提高乳铁蛋白含量，导人溶酶基因以降低乳中细菌的含量，导人乳糖酶基因降低乳中乳糖含量。5、动物乳腺生物反应器的优点乳腺组织表达的重组蛋白与天然表达蛋白在结构、功能上极其相似甚至是相同。动

13、物乳腺生物反应器生产具有生物活性的多肽药物和具有特殊营养意义的蛋白质,已成为一个新兴的转基因制药业,它的优越性有如下几点。5.1表达产物能充分修饰且具有稳定的生物活性利用DNA重组技术的微生物发酵工程来生产的药用蛋白,由于细菌等微生物不能进行蛋白质合成后的加工,因而生物活性低,需要对其进行复杂的加工才能获得有活性的目的蛋白；并且具有免疫原性,而利用转基因动物生产药用蛋白却免除这些问题。5.2产品成本低,可以大规模生产据计算，与生物发酵技术相比，动物乳腺生物反应器生产成本只有其百分之一。作为生物反应器的转基因动物可无限扩繁,且饲养成本低,可进行大规模的药物生产。而动物细胞生物反应器,虽然能生产具

14、有完全生物活性的产品,但以商业生产为目的的大规模的动物细胞培养,成本会极高且培养条件要求苛刻。5.3产品质量高,易提纯。由动物生物反应器生产的药品为纯的生物制品,避免了化学试剂及生物毒素的污染。目前,某些药用蛋白生产已达每千克乳汁含几十克,生物活性与天然蛋白几乎完全一样。乳汁中几乎不含有蛋白酶，如果在目的蛋白的N端或者C端加上His标签（不影响蛋白质的结构与功能），利用亲和层析树脂柱能够很方便将目的蛋白纯化出来【5】。5.4易于扩群，进行规模化生产作为乳腺生物反应器的转基因动物可通过繁殖或克隆技术扩大群体规模以获得最大的经济价值【9】。6、乳腺生物反应器存在的问题 尽管转基因动物乳腺生物反应器

15、技术已经取得了一定成果，展现的广阔的发展潜力和前景，但要广泛应用于生产实际还有诸多理论和技术上的问题需要解决。6.1 外源基因在动物体内的整合位点问题由于人们尚未完全掌握乳蛋白基因的表达调控规律，目的基因的整合位点及整合详细机理，因此对于导人基因在动物体内的整合位点不能适宜选择，常出现遗传性状不稳定，甚至缺失等问题。6.2 转基因表达产物的分离纯化问题表达的产物往往是理论含量高而纯化含量低，尽管比发酵工程的目的蛋白纯化要简单，要除去所有可能引起人类变态反应的蛋白和乳中的细菌、病毒等微生物，这些问题仍会给目的蛋白的纯化带来一定困难。6.3 目的蛋白的翻译后修饰问题转基因动物能够对外源蛋白进行翻译

16、修饰，而动物机体的保护系统对一切外源性物质产生排斥作用，如可能出现的蛋白水解过程，入一羧基化不充分，糖基化形式与人类不同等等【10】。6.4 转基因的技术与方法问题目前，转基因技术的实验室方法有许多，常用的是显微注射法，且此法已比较成熟，但在反刍兽上成功率较低，只有4 左右，而其他好多方法还在探索阶段。6.5 乳腺表达药用蛋白安全性问题转基因动物乳腺表达的药用蛋白，基因药用蛋白的纯度、其转运系统及口服药引起的耐受性问题；残留蛋白是否对人体正常功能产生不良影响等，这些问题在现有科学技术水平下无法下结论。7、展望尽管利用乳腺生物反应器生产目的蛋白遇到许多困难，研究还处在初级阶段，但技术路线是可行的

17、。如果ESC技术、核移植技术与转基因技术相结合，同源重组能获得目标基因的准确插入，共同整合技术以及转基因胚胎的有效筛选等方面有所突破，那么动物乳腺生物反应器的商业化前景更加广阔。参考文献1 动物乳腺生物反应器的研究内容及研究现状， 肖耀明、朱兰、殷方芝、卞益、陶军、石秀颖 上海畜牧兽医通讯年第期 20-22页.2 薛京伦，卢大儒乳腺生物反应器的研究现状J生物技术通报，1998(3)：17203 动物乳腺生物反应器研究进展，杨慧婷，王洪梅，侯明海，高运，仲跻峰，何洪彬 安徽农业科学 2011，39( 11) : 6412 6414页.4 转基因动物技术的研究进展及应用，左珂菁， 苗向阳， 谢青梅， 梁梓森，现代生物医学进展2010第10期 560-565页5 动物乳腺生物反应器的研究内容及研