大赛璐手性分析方法筛选与优化

1、业界之最业界之最享誉全球享誉全球液液- -液萃取法液萃取法生物催化法生物催化法不对称合成法不对称合成法膜分离法膜分离法传感器法传感器法结晶法结晶法毛细管电泳毛细管电泳色谱法色谱法手性分离方法手性分离方法超临界超临界 ( (sfcsfc) ) 气相色谱气相色谱（gcgc） 薄层色谱薄层色谱（tlctlc） 逆流色谱逆流色谱（cccccc） 模拟移动床模拟移动床 ( (smbsmb) ) 高效液相色谱高效液相色谱（hplchplc） 色谱法色谱法方法方法精度精度说明说明旋光法旋光法低 (5%) 非对映体异构体法非对映体异构体法高 (0.1%)几十毫克.中等 (2%)几毫克需要位移试剂.色谱法色谱法

2、高高 (0.1%)(0.1%)微克微克- -毫克毫克hplchplc、 、gcgc、 、sfcsfc对映体纯度测定方法及其比较对映体纯度测定方法及其比较几十毫克样品用量样品用量需要其它的手性化合物来制备非对映体需要真实样品手性色谱固定相法基本原理手性色谱固定相法基本原理 操作简单操作简单 不需要预处理不需要预处理 准确度高准确度高r rr r对映体分离对映体分离示意图示意图s ss ss ss ss ss ss ss ss ss sr,s r,s 消旋体消旋体( (racemateracemate) )手性选择剂手性选择剂r rs sr rr rr rr rr rr rr rr r引入手性环境

3、引入手性环境是实现手性分是实现手性分离的前提离的前提daicel手性色谱柱一览表手性色谱柱一览表正相正相l直链淀粉衍生物直链淀粉衍生物 chiralpak ad / ad-h/ad-3 chiralpak as / as-h/as-3 chiralpak ay-h/ay-3 chiralpak az-h/az-3l纤维素纤维素衍生物衍生物 chiralcel od / od-h/od-3 chiralcel oj / oj h/oj-3 chiralcel oz h /oz-3 chiralcel oa, ob, oc chiralcel of, og, ok chiralcel ca-1反相

4、反相 chiralpak ad -rh/ad-3r chiralpak as rh/as-3r chiralcel od-rh/od-3r chiralcel oj rh/oj-3r chiralpak ay rh/ay-3r chiralcel oz rh/oz-3r其它其它chiral -agp crownpak cr (), ()chiralpak ot(), op ()chiralpak wh, ma ()chiralpak qd-axchiralpak qn-ax共价键合型共价键合型 chiralpak ia/ia-3 chiralpak ib/ib-3 chiralpak ic/i

5、c-3分析条件优化流程图分析条件优化流程图 (1 (1) )酸性酸性中性中性碱性碱性hex/ipa/hex/ipa/tfatfa= =7 70/0/3 30/0.10/0.1hex/ipa/hex/ipa/deadea= =7 70/0/3 30/0.10/0.1hex/ipahex/ipa= =7 70/0/3 30 0碱性碱性样品样品mvminutes0.01.02.03.04.05.06.07.002468101214161820222410.7413.96hex/ipa/dea=90/10/0.1流量：1.0mi/min. 温度：25、检测波长：（254）流动相hex/ipa=90/1

6、0hex/ipa/acoh=90/10/0.1流动相hex/ipa=90/10-0.10-0.050.000.050.100.150.200.250.300.35mv024681012141618202224262830minutes10.940.40流量：1.0mi/min.温度：40、检测波长：（254）05101520253035mv0123456789101112131415minutes6.667.52minutes0.00.20.40.60.81.01.21.41.6mv0510152025303540酸性酸性样品样品fcoohnh2non（没出峰（没出峰 )（无法分离（无法分离

7、)*1 主要用于1级胺*2 主要用于1级氨基醇minutes0.02.55.07.510.012.515.017.520.0mv020040060080010001200mv020040060080010001200 12.24014.8531: 220 nm, 4 nmretention timeminutes051015mv0100020003000mv0100020003000 1: 220 nm, 4 nmretention timecolumn: ay-h (4.6*150mm)temp: 35flow:2.0ml/minmobile phase: co2/ipa/dea =85/1

8、5/0.1column: ay-h (4.6*150mm)temp: 35flow:1.2ml/minmobile phase:co2/ipa/1-propylamine =85/15/0.10.05.010.015.020.025.0min0100200300400mvdetector a ch1:220nm 2.22529.8790.02.55.07.510.012.515.017.520.0min-250255075100125mvdetector a ch1:220nm 12.00515.0460.02.55.07.510.012.515.017.5min-50-25025507510

9、0mvdetector a ch1:220nm 12.16414.754column: oz-h (4.6*150mm)temp: 35flow: 1.0 ml/minmobile phase:hexane/ipa/dea(75/25/0.1)column: oz-h (4.6*150mm)temp: 35flow: 1.0 ml/minmobile phase:hexane/ipa/tfa(85/15/0.1)column: oz-h (4.6(150mm)temp: 35flow: 1.0 ml/minmobile phase:hexane/ipa/tfa/dea(80/20/o.1/0.

10、05)保留时间保留时间? ?适宜的分析时间(10-30 min.)增加增加 异异丙醇丙醇 增加增加 正已正已烷烷ok!ok!分离？分离？0510152025303540455055600123456789101112131415minutes4.684.82ob15mv1234567891011121314minutes6.716.87od05101520253035404550556065mv0-505101520253035mv0123456789101112131415minutes6.667.52ad05101520253035404550556065mv012345678910111

11、2131415ojmv01020304050607080mv012345678910111213144.7090as1501020304050607080901000123456789101112131415minutes4.70ocminutes1020304050607080mv0123456789101112131415minutes4.3615ogminutes001020304050607080mv01234567891011121314minutes4.36of色谱条件色谱条件流动相： hex./ipa/ acoh = 90/10/0.1流量：1.0ml/min.温度 ：40检测波

12、长 ：uv254nm样品：fcooh选择效果最好的手性柱, 然后继续优化分析条件部分分部分分离离a.a.降低异丙醇浓度降低异丙醇浓度 b. b. 调整温度调整温度c. c. 更换醇类更换醇类05101520253035mv012345678910 11 12 13 14 15minutes6.667.52在多数情况下，降低醇的浓度可延长保持时间，改善分离度在多数情况下，降低醇的浓度可延长保持时间，改善分离度column：ad, temp.：40, flow rate：1.0ml/min. hex./ipa/ acoh =90/10/0.1hex./ipa/ acoh =100/1/0.1-0.

13、50.00.51.01.52.02.53.03.5mv051015202530354045505560minutes35.7743.71fcoohsample：flurbiprofen部分分部分分离离b. b. 调整温度调整温度c. c. 更换醇类更换醇类a.a.降低异丙醇浓度降低异丙醇浓度column：chiralpak admobile phase： hex./ipa/ acoh =90/10/0.1, flow rate：1.0ml/min. 2540temp.： ： 5fcooh降低柱温降低柱温可增大可增大值，但会使峰形变宽值，但会使峰形变宽升高柱温升高柱温会减少会减少值，但会使峰形尖

14、锋值，但会使峰形尖锋-0.50.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.00123456789101112131415minutes8.7212.13:1.59mvminutes0510152025303501234567891011121314156.667.52:1.23mv01234567890123456789101112131415minutes7.669.12:1.320.02.55.07.5min-10-505101520mvdetector a ch1:200nm 3.2173.732temp.： 25rs: 1.990.02.55.07.5mi

15、n0255075mvdetector a ch1:200nm 4.3355.281temp.： 20rs: 2.78temp.： 15rs: 3.560.02.55.07.5min010203040506070mvdetector a ch1:200nm 4.3975.661column: crownpak cr(+) (4.6*150 mm)mobile phase: ph=1.0高氯酸高氯酸 flow: 0.3 ml/minsample: 苏氨酸苏氨酸部分分部分分离离c c. .更换醇类更换醇类b. b. 调整温度调整温度a.a.降低异丙醇浓度降低异丙醇浓度由异丙醇换为乙醇由异丙醇换为乙醇

16、-选择性增大选择性增大hex./ipa/acoh=90/10/0.1fcoohipa和和etoh有时会使峰形和有时会使峰形和值发生明显变化值发生明显变化column：chiralpak adtemp.：40, flow rate：1.0ml/min. sample：flurbiprofen05101520253035mv0123456789101112131415minutes6.667.52 =1.2305101520253001234567891011121314157.589.64 =1.45mvminuteshex./etoh/acoh=95/5/0.10.05.010.015.020

17、.025.0min0255075100mvdetector a ch2:254nm 20.24121.4240.02.55.07.510.012.515.0min050100150200250300mvdetector a ch2:254nm 10.01113.410column: ay-h (4.6x250mm)temp: 35flow:1.0 ml/minmobile phase:hexane/ipa/dea(90/10/o.1)column: ay-h (4.6x250mm)temp: 35flow:1.0 ml/minmobile phase:hexane/etoh/dea(90/10

18、/o.1)01020min0250500mvdetector a ch1:220nm 0.05.010.0min0250500750mvdetector a ch1:220nm 8.47511.818ia-h80i20dea0.1-1.0mlmin-35ia-m100dea0.1-1.0mlmin-350.02.55.07.510.012.515.017.5min-50-250255075100mvdetector a ch1:220nm 12.16414.7540.02.55.07.510.012.5min050100150200250300350mvdetector a ch1:214nm

19、 5.0117.462oz-h， ，hexane/ipa /tfa/dea= 80/20/0.1/0.05（ （v/v/v)， ，1.0 ml/min oz-h， ，meoh/dea=100/0.1（ （v/v)， ，0.8 ml/min chiralpak ia/ib/icchiralpak ia/ib/ic研发背景研发背景chiralpak ia, ib, iconhch3ch3oroororonroroororononhch3ch3ronhclclroroororonchiralpak iachiralpak ibchiralpak icnew!l 流动相组分没有任何限制流动相组分没有任

20、何限制l 可以选用任何有机溶剂溶解样品可以选用任何有机溶剂溶解样品l 新的手性选择性新的手性选择性l 可以再生，寿命长可以再生，寿命长l 正相与反相可以在同一支柱子上实现正相与反相可以在同一支柱子上实现对对于一些化合物，分于一些化合物，分离度可能离度可能优优于涂布型于涂布型0.02.55.07.5min0250500750mvdetector a ch1:220nm 0.01.02.03.04.05.0min0250500750mvdetector a ch1:220nm 分离度优于涂布型分离度优于涂布型实例实例column: ad-h (4.6x250mm)temp: 35flow:1.0

21、ml/minmobile phase: hexane/ipa/dea (90/10/0.1)column: ia (4.6x150mm)temp: 35flow:1.0 ml/minmobile phase: hexane/ipa/dea (90/10/0.1)0.02.55.07.510.0min0250500750mvdetector a ch1:220nm 0.02.55.07.5min050100150200mvdetector a ch1:220nm 3.9445.528由于在流动相中改善了溶由于在流动相中改善了溶解度，柱效优于涂布型解度，柱效优于涂布型column: ad-h (4

22、.6x250mm)temp: 35flow: 1.0 ml/minsolubility: 0.5 mg/mlmobile phase: hexane/ipa (70/30)column: ia (4.6x250mm)temp: 35flow: 1.0 ml/minsolubility: 7.0 mg/mlmobile phase: mtbe/meoh (80/20)更高的柱效，更好的更高的柱效，更好的峰形峰形chromatographic condition: hexane/ipa, 90/10 (v/v)通过溶剂多样性优化手性分离通过溶剂多样性优化手性分离ibib含水流动相含水流动相非水与水

23、相体系通用非水与水相体系通用ch3nnoch302468101250100150200250300a= 2.810 0101020200.000.000.010.010.020.020.030.030.040.040.050.05a= 2.36a= 1.960 01 12 23 34 45 56 67 78 89 910101111 12121313 14140 00.10.10.20.20.30.30 02 24 46 68 81010121214140.00.00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.0a= 1.790 0101020200.000.000.010.010

24、.020.020.030.030.040.04a= 1.7002468101214050100150200250a= 1.650 0101020200.00.00.10.10.20.2a= 1.63a= 1.330 02 24 46 68 81010121214140.00.00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.0修复再生后修复再生后（可使用各种强极性溶剂）（可使用各种强极性溶剂）柱性能受损柱性能受损（ 如受强吸附杂质的影响）如受强吸附杂质的影响）oofoohoh样品样品新色谱柱新色谱柱 ia柱的修复再生方法：第一：第一：etohetoh 0. 0.4 4ml/min 3

25、0minml/min 30min第二：第二：dmf 0.3ml/min 3hdmf 0.3ml/min 3h第三：第三：etohetoh 0.3ml/min 50min 0.3ml/min 50min第四：第四：h/e=90/10h/e=90/10还不行，再用下面条件还不行，再用下面条件第一：第一：etohetoh 0. 0.4 4ml/min 30minml/min 30min第二：第二：thf 0.5ml/min 2hthf 0.5ml/min 2h第三：第三：etohetoh 0. 0.4 4ml/min 30minml/min 30min第四：第四：dmf 0.3ml/min 3hdm

26、f 0.3ml/min 3h第五：第五：etohetoh 0.3ml/min 50min 0.3ml/min 50min第六：第六：h/e=90/10h/e=90/10 ib ic柱的修复再生方法：第一：第一：etoacetoac 1ml/min 30min 1ml/min 30min，有添加剂的，有添加剂的2h, 2h, 室温保存室温保存2 2天天第二：第二：h/i=90/10 1ml/min 1hh/i=90/10 1ml/min 1h键合型固定相筛选一般流程键合型固定相筛选一般流程l 选用比较典型的溶剂组合作为起始筛选流动相选用比较典型的溶剂组合作为起始筛选流动相 hexane/ipa（

27、etoh） hexane/thf(dcm, ea) mtbe/ meoh (ipa,etoh） mtbe/ thf(dcm, ea) acn/ meoh (ipa,etoh）l 如果分析物的溶解度不好，优先选用溶解度好的有机溶剂作为流动相组分如果分析物的溶解度不好，优先选用溶解度好的有机溶剂作为流动相组分l 使用多元流动相优化分离使用多元流动相优化分离(mpa)()od-rh*1=90/100/1001054027oj-rhas-rh540*229*2,3ad-rh新新产产品：品： ay-rh / oz-rh根据样品性质选择流动相根据样品性质选择流动相样品性质od-rh、oj-rhad-rh、

28、as-rh中性水/乙腈酸性磷酸水溶液(ph2)/乙腈0.1m 磷酸缓冲液(ph2)/乙腈碱性0.1m kpf6 水溶液/乙腈0.1m napf6水溶液/乙腈20mm 硼酸缓冲液(ph9)/乙腈20mm 磷酸缓冲液(ph8)/乙腈1） 酸性流动相： 甲酸、乙酸2） 碱性流动相： 碳酸氢氨（醋酸铵，甲酸铵）反相流动相的反相流动相的ph值对分离度的影响值对分离度的影响 (as-rh )ooh中性化合物benzoinonhoco oh酸性化合物n-cbz-norvaline碱性化合物ofloxacin ethyl esteronnnfoco oet水溶液水溶液/ch3cn=60/40流速：1.0ml/

29、min.水溶液/ch3cn=60/40流速：1.0ml/min.水溶液/ch3cn=80/20流速：0.5ml/min.051015mv02468101214minutes7.168.77024681012mv0123456789 10minutes2.250.01.02.03.04.0mv0 5 1015202530354045505560minutes27.79水磷酸水溶液(ph2)硼酸缓冲液(ph9)051015mv02468101214minutes7.118.7005101520mv0.02.04.06.08.0minutes4.174.69020406080mv0 5 101520

30、2530354045505560minutes4.004.484.77051015mv02468101214minutes6.978.53010203040506070mv0123456789 10minutes1.850.02.04.06.08.00 5 1015202530354045505560minutes30.7436.78有机溶剂种类对分离的影响有机溶剂种类对分离的影响12.1813.548.208.8411.5212.358.2114.1215.787.457.97水水/乙腈乙腈=50/50水水/乙醇乙醇=35/65水水/甲醇甲醇=25/75ooh2-methyl-1-tetra

31、lone2-phenyl-2-butanol 手性柱手性柱： chiralpak ad-rh 、流速流速：0.5ml/min、温度、温度：25反相柱分析条件优化的总结反相柱分析条件优化的总结手性色谱柱组合筛选手性色谱柱组合筛选chiralpak ad-h chiralpak as-h chiralcel od-hchiralcel oj-hchiralpak ay-hchiralcel oz-hchiralpak ia chiralpak ibchiralpak ic： 0.46cmi.d.15cml组合筛选设备组合筛选设备ipa泵泵紫外检测器紫外检测器色谱柱自动切换阀色谱柱自动切换阀流动相流

32、动相2自动进样器自动进样器组合筛选设备示意图组合筛选设备示意图流动相流动相1溶剂切换阀溶剂切换阀旋光检测器旋光检测器串联旋光检测器的好处串联旋光检测器的好处 11.1.用用uvuv检测器只出现检测器只出现“峰峰”的时候的时候 应用旋光检测器可确认其分离状况应用旋光检测器可确认其分离状况2. 2. 可确认洗脱顺序可确认洗脱顺序串联旋光检测器的好处串联旋光检测器的好处 2若筛选没得到理想的分析条件时若筛选没得到理想的分析条件时daicel大部分手性柱是涂敷型产品，在市场上具有独特性。大部分手性柱是涂敷型产品，在市场上具有独特性。若导入错误的溶剂若导入错误的溶剂(ch2cl2、乙酸乙酯、甲苯等、乙酸乙酯、甲苯等)，柱子会马上被破坏，柱子会马上被破坏。当流动相或样品溶液导入错误的溶剂时，柱压剧增，分离突然变差当流动相或样品溶液导入错误的溶剂时，柱压剧增，分离突然变差。一旦错误地使用了溶剂，重新恢复柱子性能的可能性很低。一旦错误地使用了溶剂，重新恢复柱子性能的可能性很低。若您遇到此类分析故障，请对照出厂报告重新确认柱子的性能或与大若您遇到此类分析故障，请对照出厂报告重新确认柱子的性能或与大赛璐联系赛璐联