表达载体的构建方法及步骤

1、表达载体的构建方法及步骤、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类，其中质粒DNA是一种新的非病毒转基 因载体。一个合格质粒的组成要素:(1) 复制起始位点 Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA分子有多个复制起始位点。抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+,Kan+多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段P/E启动子/增强子Terms终止信号加poly (A)信号可以起到稳定mRNA作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。 如 果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体

2、。载体选择主要考虑下述3点:【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表 达载体。21 .载体的类型:(1) 克隆载体的克隆能力据克隆片段大小 (大选大，小选小)。如vlOkb选 质粒。(2) 表达载体据受体细胞类型原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。(3) 对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为 相应载体的参考。【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与 载体易于链接，不能产生阅读框架错位。综上所述，选用质粒(最常用)做载体的

3、 5点要求:(1)选分子量小的质粒，即小载体(1 1.5kb )-不易损坏，在细菌里面拷贝 数也多(也有大载 体）;(2) 般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒10个。(3)必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地;(4) 必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr (试一 试)。(5)满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性(如Puro、G418 )等等。无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接

4、。如何阅读质粒图谱第一步：首先看 Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。Ampr水解P内酰胺环，解除氨苄的毒性。tetr可以阻止四环素进入细胞。camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。neor （kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使 G418 （长那霉素衍生物）失活hygr使潮霉素p失活。第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基 因的插入。如果在这些酶切位点以外有外源基因的插入， 会导致某种标志基因的 失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。10Kb的外源第四步：再看外源 DN

5、A插入片段大小。质粒一般只能容纳小于DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。第五步：是否含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录 终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。 克隆载体中加入一些与表达调控 有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。第六步：启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号（1）启动子促进 DNA转录的DNA序列，这个DNA区域常在基因或操纵子编码序列的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始 转录的部位，但启动子本身不被转录。(2)增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒

6、基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。 即在所 调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子一负增强子，负调控序列。(3) 核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs)： mRNA 有核糖 体的两个结合位点，对于原核而言是 AUG (起始密码)和SD序列。(4) 转录终止序列(终止子)/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA的保守序列，此位点 down stream 有一段 GT或T富丰区，这2部分共同构成Poly (A)加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有 一个 AATAAA 的保守序列，此位点down

7、stream 有一段GT或T富丰区, 这2部分共同构成poly (A)加尾信号。质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一 条链上.根据表达宿主不同，构建时所选择的载体也会不同。二、目的基因的获得 一般来说，目的基因的获得有三种途径: 调取基因：根据目的基因的序列，设计引物从含有目的基因的cDNA中通过PCR 的方法调取目的基因，链接到克隆载体挑取单克隆进行测序， 以获得想要的基因 片段，这种方法相对成本较低，但是调取到的基因往往含有突变， 还有不同基因 的表达丰度不同，转录本比较复杂，或是基因片段

8、很长，这些情况都很难调取到 目的基因。全基因合成：根据目的基因的 DNA序列，直接设计合成目的基因。此方法准确性高，相对成本会高一些，个人操作比较困难，需要专业的合成公司完成。优点 是可以合成难调取及人工改造的任何基因序列， 同时可以进行密码子优化，提高 目的基因在宿主内的表达量。三、克隆构建 目前，克隆构建的方法多种多样，除了应用广泛的酶切链接以外， 现在还有很多 不依赖酶切位点的克隆构建方式。下面具体说一下双酶切方法构建载体的步骤。实验材料实验试剂生产厂家试剂名称载体 PCDNA3.1Tran shee p大肠杆菌菌株DH5 aTiangenDNA ladderFerme ntasFerm

9、e ntas凝胶回收试剂盒Axygen限制性内切酶T4连接酶Ferme ntas质粒DNA小，大量抽提试剂盒Axygen琼脂糖Biowest(2) X基因慢病毒载体的构建X基因基因由Tran sheep全基因合成，构建于载体 P UC57中。PUC57-X 基因 EcoRI/BamHI 酶切结果:酶切完成后进行胶回收2.载体用PCDNA3.1双酶切，酶切体系如下。20ul酶切体系37度3小时 4ul PCDNA3.1 载体(500 ng/ul )1ul BamHI 1ul EcoRI 2ul 10 xbuffer 12 ul H2O酶切完成后胶回收(见附录)处理好的目的片段与载体连接反应体系:

10、6ul PCR酶切回收片段（约50ng/ul ）1ul酶切好的载体（约50ng/ul） 2ul ligase buffer 1ul T4ligase 10ul H20以上连接液在16 °C过夜。转化（感受态细胞：DH5a）,具体步骤见附录转化部分。抗性：Amp; 37 C,培养过夜转化后X基因分别平板挑菌,37 C 250转/分钟摇菌14小时，PCR鉴定后，将阳性菌液送上海权阳生物技术有限公司测序。X基因慢病毒载体单克隆菌落 PCR鉴定（使用载体通用引物，PCR条带大小应比实际大200bp左右）：仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途。For P ersonal use only

11、in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen fu r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude et la recherche uniquementa des fins personnelles; pasa des fins commerciales.T 0 J! b K 0 gHjirogeHKC, TOpBi(enob3 gioimo 麻yrneHHucic 码 egoBua Hudo 贝冶hmucno 员 b30BaTbc 刃B KOMMepqecKux仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途。For P ersonal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen fu r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tud