细胞凋亡实验步骤及注意事项

1、细胞凋亡实验步骤及注意事项、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、 起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种 不同类型。 凋亡普遍存在于生命界， 在生物个体和生存中起着非 常重要的作用。 它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件 的组合， 是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。 细 胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触， 细胞变园， 细胞膜 向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或 新月状分布、 内质网和细胞膜进一步融合将细

2、胞分成多个完整包 裹的凋亡小体， 凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。 在凋亡过程 中细胞内容物并不释放到细胞外， 不会影响其它细胞， 因而不引 起炎症反应。在生物化学上， 多数细胞凋亡的过程中， 内源性核酸内切酶活化， 活性增加。核 DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解 为 180-200bp 或它的整倍数的各种片断。 如果对核 DNA 进行琼 脂糖电泳，可显示以 180-200bp 为基数的 DNAladder （梯状带 纹）的特征。相比之下， 坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。 细 胞在坏死早期即丧失质膜完整性， 各种细胞器膨胀， 进而质膜崩 解释放出其中的内容物， 引起

3、炎症反应， 坏死过程中细胞核 DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的 DNA 片断，不能形成梯 状带纹，而呈弥散状。一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡， 通常这 些因素在诱导凋亡的同时， 也可产生细胞坏死， 这取决于损伤的 剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，0.025急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明 HT 在u g/m范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。 本实验用1 u g/mlHT在体外诱导培养的HL-60 细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33

4、342 和碘化丙啶（propidiumiodide ， PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如 PI 等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整， PI 就进入细胞内部，它可嵌入到 DNA 或 RNA中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞培养基在37 C,5%CO2 条件下培养。不着色。 而一些活细胞染料由于为亲脂性物质， 可跨膜进入活细 胞，因而可进行活细胞染色。 Hoechst33342 是一种活性荧光染 料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与 DNA 特异结 合（主要结合于 A-T ）碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是 看到

5、有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。三、实验用品1、试剂：三尖杉酯碱（HT） , 300 U g/m, 100mmol/LTris-HCIpH7.5 ）， 5mol/LEDTA 缓冲液、碱性裂解液：0.2mol/LNaOH,1%SDS 、醋酸钠： 3mol/LKAc （ pH4.8 ）；异丙 醇； 70%乙醇；溴酚蓝，蔗糖指示剂。 TBE 电泳缓冲液， 1%琼脂糖，溴乙锭。PI母液：500卩g/ml; Ho33342母液：2mmol/L。2、仪器设备：荧光显微镜，电泳仪，电泳槽，微量加样器（1ml, 100al0.5、 1.5ml 离心管，载玻片，盖玻片。四、实验材料人早幼粒白血病HL-60 细胞，

6、用含 1 0%小牛血清的 RPMI1640五、方法步骤1、三尖杉酯碱诱发 HL-60 细胞凋亡(1 )实验前约24小时，接种两瓶HL-60细胞，标记、，每瓶含约6ml培养液，置37 C, 5%CO2培养箱培养。2)实验前约 2.5 小时，当细胞密度达到 70% ，号瓶加入三尖杉酯碱2001使终浓度为1卩g/ml,号瓶中加入同等量PBS(pH7.4 )作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5 小时。2、 Ho33342 和 PI 双重染色鉴别三种细胞(1)染色：将瓶中的细胞摇匀取 200 于1.5ml的离心管中，加入HO33342母液2卩,P120卩,染色15分钟。2)滴片：取一载玻片用双面胶围成

7、一小室，从离心管中各取以上染色后的细胞悬液 10卩l加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫外激发光，高倍镜下观察，区别三种细胞，并注意三者 比例。1. 诱导培养 HL-60 细胞时间要准确；2.荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。其 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死他 两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网

8、扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核 DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断， 降解为 180-200bp 或它的整倍数的各种片断。如果对核 DNA 进行琼脂糖电泳，可显示以 180-200bp 为基数的DNAladder （梯状带纹）的特征。相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏