葛根素对大鼠肢体缺血再灌注后肺损伤的保护作用

1、 葛根素对大鼠肢体缺血再灌注后肺损伤的保护作用 浦践一1，孙瑞军2，赵琪2，门秀丽2#，张连元2 （1.华北煤炭医学院附属医院，2.华北煤炭医学院病理生理学教研室，河北 唐山 063000）摘要 目的：观察葛根素预处理对大鼠肢体缺血再灌注后肺损伤的保护作用。方法：将健康雄性Wistar大鼠随机分为3组(n =10):对照组(Control)，肢体缺血再灌注组(LIR)和葛根素预处理组(Puerarin，Pue组)。各组大鼠均于肢体缺血4h 再灌注4h 处死,分别测定其动脉血氧分压(PaO2)和二氧化碳分压(PaCO2)，肺组织丙二醛(MDA)、Na+-K+-ATP酶活性、肺组织湿干比(W/D)

2、及肺组织髓过氧化物酶(MPO)含量，并观察肺组织在光镜下形态学的变化。结果:大鼠LIR后4h，PaO2明显降低；W/D值、血浆及肺组织的MDA含量和肺组织MPO活性均明显增加。Na+-K+-ATP酶活性降低，光镜下显示毛细血管扩张充血、血管周围间隙增大、肺间质多形核粒细胞(PMN)聚集和浸润。与LIR组比较，给予Pue预处理组大鼠各项损伤指标明显减轻，Na+-K+-ATP酶活性升高。结论:葛根素预处理对大鼠肢体缺血再灌注后肺损伤产生一定的保护作用,其机制可能与提高Na+-K+-ATP酶活性、减轻脂质过氧化反应有关。关键词：葛根素；缺血再灌注；肺损伤；肢体Protective effects o

3、f puerarin on lung injury following limbs ischemia reperfusion of rats Pu jianyi1, Sun ruijun2, Zhao qi2, Men xiuli2#, Zhang lianyuan2 1. The affiliated hospital, North China Coal Medical University, 063000, Tangshan 2. Department of Pathophysiology, North China Coal Medical University, 063000, Tang

4、shan Abstract Objective : To investigate the protective effect s of puerarin on lung injury following limbs ischemia reperfusion of rats. Methods : Wistar rats were randomly divided into three groups (n =10): control group (Control), limbs ischemia reperfusion (LIR) group, and puerarin (Pue)group. A

5、t the end of the experiment, the partial pressure of oxygen (PaO2) and the partial pressure of carbon dioxide(PaCO2) in the artery blood and the contents of MDA, Na+-K+-ATPase, the ratio of W/D and MPO of lungs were measured. Results: After the ratshind limbs suffered ischemia reperfusion, the level

6、 of PaO2 and the activity of Na+-K+-ATPase decreased and the values of W/D, MDA and MPO of the lung tissue increased significantly in the LIR group; Under optical microscopy, there were congestion and swelling in pulmonary microvessels with broadened the spaces around the blood vessels. Leucocyte as

7、sembling and infiltration took place, which was dominated by polymorphocytes after LIR. Compared with LIR group, puerarin could attenuate lung tissue injury and increased the activity of Na+ -K+ -ATPase of lung tissues. Conclusion: Puerarin can protect the lung of rats from injury induced by limbs i

8、schemia reperfusion.Key words: puerarin, ischemia reperfusion, lung injury, limb. 多种原因，如腹主动脉瘤手术、四肢大血管栓塞或损伤、严重肢体挤压伤、断肢再植及肢体手术长时间应用止血带等均可造成肢体缺血。部分肢体恢复充足的血供后不仅缺血骨骼肌出现损伤，而且还可出现机体多个脏器的功能和结构的损害。肺脏作为最易受损的器官之一，若损伤严重，则可导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，但目前对其发生机制尚未完全阐明。目前认为缺血再灌注导致的组织细胞损伤与缺血再灌注产生大量氧自由基、细胞Na+ -K+ -ATP酶活性降低及细胞内

9、钙超载等有关1,2。葛根素是一种天然多酚类化合物,结构类似雌二醇,具有某些雌激素样作用,研究发现它是一种天然的抗氧化剂,具有明显的抗氧化作用,可消除体内过多的自由基,保护细胞膜的结构3。另有研究表明葛根素对缺血再灌注所致心、脑损伤有保护作用2,4,5。但葛根素对肢体缺血再灌注后肺损伤的影响尚无定论。本实验通过建立大鼠肢体缺血再灌注损伤模型，经葛根素预处理，观察肺呼吸功能、肺组织中丙二醛(MDA)含量和髓过氧化物酶(MPO)的活性及Na+ -K+ -ATP酶活性的改变，从而探讨葛根素对大鼠肢体缺血再灌注后肺损伤的影响。1 材料与方法1.1 动物与分组 健康雄性Wistar 大鼠30只,体重200

10、-250g,喂养10d，随机分成三组(n =10): (1)Control组: 常规饲养；(2)LIR组:常规饲养；(3)Pue组:术前7d,每天口服灌胃50 mg/kg的葛根素。1.2 动物模型复制 术前12h禁食，LIR组和Pue组按我室已成功构建的方法6复制动物模型。在乙醚浅麻醉下，用止血带于双后肢根部结扎4h 后松带恢复血流灌注，对照组不结扎肢体其余操作同LIR组动物。1.3 标本采集及检测 全部动物分别于实验第8h (松解肢体结扎后4h)末，经腹主动脉放血处死动物,取动脉血后立即用自动血气分析仪测定动脉血氧分压(PaO2) 和二氧化碳分压(PaCO2)。迅速取出肺脏,右肺300mg制

11、成10%组织匀浆,分别测定Na+ -K+ -ATP酶活性、MDA含量和MPO活性(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供)。另取取肺组织约300mg，用滤纸吸净表面血迹后称湿重,置于80烤箱烘干72h后取出称干重,计算W/D比值。取左肺做组织学检查。1.4 统计学分析 结果以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS11.5 软件处理实验数据,组间比较用One-WayANOVA,q检验。2 结果2.1 各组动物血气分析结果及W/D 的变化 LIR组与Control组比较，W/D值明显升高，PaO2明显降低；Pue组W/D值虽然高于Control组，但较LIR组明显降低，并且Pue

12、组大鼠PaO2明显高于LIR组，差异均具有显著性(表1) 表1 各组动物血气分析结果及W/D的变化（x±s,n=10） Tab1 Results of blood gas analysis and the changes of W/D of lungs in different groups (x±s,n=10 ) Group PaO2 (mmHg) PaCO2 (mmHg) W/D Control 98.4 ±8.21 38.14 ±5.93 4.05 ±0.64 LIR 62.7 ±4.75* 35.23 ±7.27 5

13、.52 ±0.34* Pue 81.5 ±5.62# 36.67 ±4.26 4.58 ±0.21# *P<0.05,*P<0.01 vs Control group;#P<0.05,#P <0.01 vs LIR group2.3 各组动物肺组织Na+-K+-ATP酶活性、MDA和MPO的变化 LIR组与Control组比较,大鼠肺组织MDA和MPO均有不同程度的升高，但Na+-K+ -ATP酶活性显著降低；与LIR组比较，Pue组Na+-K+-ATP酶活性升高，MDA和MPO均有不同程度的降低。差异均具有显著性(表2). 表2

14、 各组动物肺组织Na+-K+-ATP酶活性、MDA和MPO的变化（x±s,n=10） Tab2 Changes of the activity of Na+-K+-ATPase and the level of MDA, MPO of lungs in different groups (x±s,n=10 ) Group Na+-K+-ATPase MDA MPO (molPi/mg pro/h) (nmol/mg pro) (U/g) Control 6.04±1.81 1.15 ±0.23 1.75 ±0.41 LIR 4.73±

15、0.84* 1.96 ±0.31* 2.48 ±0.19* Pue 5.45±1.62# 1.38 ±0.26# 1.89 ±0.33# *P<0.05,*P<0.01 vs Control group;#P<0.05,#P <0.01 vs LIR group2.3 光镜下肺组织的形态学变化 与对照组比较,LIR组动物肺组织水肿,毛细血管扩张充血,血管周围间隙增大,有大量白细胞浸润,血管床中亦有大量炎性细胞聚集、附壁。而Pue组肺组织病变减轻(图1)。 Control LIR Pue图 1. 各组肺组织形态改变的比较F

16、ig1. Comparison of the changes in the lungs of different groups. (HE×200)3.讨论 各种原因造成的肢体缺血是一种常见的临床征象，恢复充足的血液供应乃缺血组织成活之关键，但是部分缺血组织回复血流灌注后又可导致缺血组织的进一步损伤，此称为肢体缺血再灌注(LIR)损伤。如果缺血组织的范围较广泛，如腹主动脉瘤手术、主要的血管栓塞或损伤、高位肢体离断、严重肢体挤压伤及长时间应用止血带等，再灌注损伤不仅存在于缺血组织，尚可进一步引发远隔器官的损伤7。以前的研究表明，肢体缺血再灌注可继发急性肺损伤，这种损伤的机制与氧化应激密切

17、相关8。 葛根为豆科植物Pueraria labta(Wild) Ohwi的干燥根,味甘,性辛凉,葛根素(C21 H20 O9 ) 为葛根的干燥根中分离、提取得到的8-D-葡萄吡喃糖-4,7-二羟基异黄酮9。有研究表明葛根素对缺血再灌注所致心、脑损伤有保护作用2,4,5。 本实验发现，LIR后PaO2明显下降，PaCO2也有所下降，表明肺换气功能障碍，W/D 升高提示肺含水量增加，这与光学显微镜下肺组织水肿、血管周围间隙增大、肺毛细血管通透性增高的结果相符合；肺泡上皮型细胞的Na+-K+-ATP酶在肺泡液体主动转运功能中占主导地位。而LIR组肺组织含水率的增加和Na+-K+-ATP酶活性降低说

18、明这种肺水肿的形成与Na+-K+-ATP酶活性降低有关。肺组织MDA水平升高说明氧自由基介导了肺组织细胞的损伤。肺组织MPO含量明显升高表明肺组织有PMN浸润，而PMN是活性氧的重要来源。预防性应用抗氧化剂可抑制脂质过氧化过程10。本研究中的应用葛根素预处理可在一定程度上抑制肺组织MDA水平升高,降低MPO活性，维持Na+-K+-ATP酶活性在较高水平,减轻肺损伤，改善呼吸功能障碍。 急性肺损伤发病机制错综复杂，多种效应细胞和介质参与了其发生发展过程,具体机制有待于进一步探讨。本研究提示，葛根素能够显著改善大鼠肢体缺血再灌注后的急性肺损伤可能与其降低氧自由基水平、减轻脂质过氧化反应，提高Na+

19、-K+-ATP酶活性有关。参考文献1.沈炳权，蔡兆斌，徐群红等。葛根素对家兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用J. 中国中西医结合急救杂志,2004,11(6):361-3632.唐瑜 葛根素对脑缺血再灌注损伤保护机制的研究现状J. 四川生理科学杂志,2006, 28(4):177-1793. Boue SM, Wiese TE, Nehls S, et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens. J Agric Food Chem, 2003, 51 (8): 2193-21994.张远荣，蒋企洲。葛根素的抗氧化活性