流式细胞术应用技巧

1、 利用流式细胞仪利用流式细胞仪( flow cytometer ) 通过检测荧光通过检测荧光信号来检测细胞或其它颗粒性物质（表面或胞浆或胞信号来检测细胞或其它颗粒性物质（表面或胞浆或胞核）的物理、化学特性并通过这些特性对细胞或颗粒核）的物理、化学特性并通过这些特性对细胞或颗粒进行进行定量。定量。 & 检测表面标记物检测表面标记物 & 检测胞浆标记物检测胞浆标记物 & 检测胞核内标记物检测胞核内标记物 & 检测可溶性蛋白检测可溶性蛋白流式细胞术流式细胞术（FLOW CYTOMETRY）一、流式细胞仪的原理应用技巧的基础光源：光源：激光激光(488nm 氩离子空冷激

2、光氩离子空冷激光) 细胞：细胞： 单细胞悬单细胞悬液液 液流：液流：鞘液鞘液(Sheath Fluid) 流动室：流动室：Flow Cell检测器：检测器：光电倍增管光电倍增管(PMT)检测信号：检测信号：散射光散射光(FS，SS)，荧光信号，荧光信号(FL1FL4)统计分析：统计分析：计算机计算机散射光信号 FS 细胞大小 SS 细胞颗粒性荧光信号 FL1 FITC FL2 PE FL3 ECD FL4 PC5 FL5 - PC7 用荧光标记抗体抗体特异性地结合细胞上对应的抗原表达该抗原的细胞被标记上荧光；抗原表达多的细胞荧光强度强阳性细胞百分比或浓度靶蛋白浓度（1）、直标和间标（2）、细胞

3、膜标和细胞内标（3）、两种染色：抗体和染料（4）、组合标记间接免疫荧光标记法间接免疫荧光标记法直接免疫荧光标记直接免疫荧光标记法法抗原分布:Important for method optimization 表面，胞浆，核内 是共同检测还是分别检测？CD3, CD4, CD8, tetramercytokinesDNACD3,4,8, tetramer+CytokinesCD3,4,8, tetramer+DNACytokines+DNACD3,4,8, tetramer+Cytokines+DNAIntracellular Cytokine-Protocol（1）、方案：两种图形（散点图、直

4、方图）（2）、百分率信息、强度信息（3）、分群：细胞大小（FS）细胞内颗粒（SS）（4）、设阈值、设门特征（细分）（5）、直接信息、间接信息二、流式细胞仪的应用技巧一 整合项目，树立体系化概念，提高流式使用价值白血病全过程评价患者出现症状各种抗原（参照白血病抗原选择原则）诊断白血病，确诊疾病，对白血病进行分型以指导治疗治疗初诊时所用抗原中能够代表白血病细胞的特殊抗原评价疗效及治疗的疗程同上缓解期动态跟踪患者缓解期的白血病细胞变化，及时控制在相应水平下临床过程FCM检测项目意义CIK细胞治疗过程的评价治疗前病人免疫状况评价T亚群、NK、CIK、细胞因子是否适合做、能否能培养、值得做CIK采集MN

5、CMNC数目、纯度、 T亚群、NK、CIK数目及比例是否达到培养要求、调节细胞数MNC数目、 T亚群、NK、CIK数目及比例、CD3、CD8活化状况培养培养是否达标、回输时机回输后T亚群、NK、CIK、细胞因子疗效评价、监测、下次治疗的时机CIK治疗程序FCM检测项目意义云云 南南 省省 肿肿 瘤瘤 医医 院院 肿肿 瘤瘤 研研 究究 所所 流流 式式 细细 胞胞 术术 报报 告告 单单 生物免疫治疗检测报告生物免疫治疗检测报告 门诊号: 住院号: 42435 姓 名 曹淑英 性别 女 年龄 75 科别 腹一 编号 52 病床号 临床诊断 胃癌术后 送检标本 培养物 日期 2006 年 02

6、月 13 日 流式细胞检测及分析结果：流式细胞检测及分析结果： 采 集 前 培 养 后 项 目 % ABS（610） % ABS（610） CD45+CD3+ 58.5 1068 95.5 679 CD45+CD3+CD4+ 30.8 - 60.8 - CD45+CD3+CD8+ 21.1 - 21.4 - CD45+CD3-CD56+ 17.0 245 4.6 33 CD45+CD3+CD56+ 0.5 7 43.4 310 HLA DR-CD3+ 54.8 - 24.1 - HLA DR+CD3+ 15.3 - 67.2 - HLA DR-CD8+ 31.0 - 14.9 - HLA DR

7、+CD8+ 2.0 - 20.7 - 检测日期 2006 年 01 月 13 日 2006 年 01 月 20 日 送检医生 周永春 实验者 金从国、李佳 报告日期 2006 年 02 月 20 日 肿瘤细胞免疫特点AIDS全过程免疫细胞评价基础免疫水平T亚群、NK、CIK当地不同年龄、性别、民族的免疫水平基础数据高危人群HIV检测阳性T亚群、NK、CIK、 CD4凋亡、细胞因子HIV检测阳性前的免疫水平变化状况及CD4的凋亡T亚群、NK、CIK 、CD3、CD4、CD8活化状况、细胞因子、CD4凋亡HIV阳性AIDS检出HIV到发病的情况AIDS病人治疗T亚群、NK、CIK、细胞因子、CD4

8、凋亡、 CD3、CD4、CD8活化状况疗效评价、监测、治疗效果及病情动态观察AIDS过程FCM检测项目意义骨髓移植或CD34细胞移植供者动员效果监测图051015202530358月4日8月5日8月5日8月6日8月6日8月7日8月7日8月8日8月8日WBC(x 109/L)MNC(x108/L)CD34+ ( x 106/L)云云 南南 省省 肿肿 瘤瘤 医医 院院 肿肿 瘤瘤 研研 究究 所所 流流 式式 细细 胞胞 术术 报报 告告 单单 干干/ /祖细胞相对绝对计数报告祖细胞相对绝对计数报告 流式号： 门诊号: 住院号 外院 姓 名 李艳华 性别 男 年龄 25 科别 外院 标本号 20

9、070919 病床号 8 临床诊断 NHL 送检标本 外周血 日期 2007 年 09 月 19 日 流式细胞检测及分析结果：流式细胞检测及分析结果： 项目 相对计数 绝对计数 MNC 41.1% 30 x 108/L CD34+ 1.0% 30 x 106/L CD34+CD38- 0.9% 27 x 106/L CD34+CD38- 0.1% 3 x 106/L 送检医生 何迪 实验者 金从国、陈晓群 报告日期 2007 年 09 月 19 日 凋亡启动凋亡启动细胞内细胞内Ca2+ 动员动员 Caspase激活激活脱水致细胞皱缩脱水致细胞皱缩核染色质凝缩核染色质凝缩 线粒体膜电位丧失线粒体

10、膜电位丧失 细胞膜细胞膜PS外翻外翻 核碎片形成核碎片形成DNA被切割成低分子量片段被切割成低分子量片段细胞内酸化细胞内酸化凋亡小体形成凋亡小体形成三、流式细胞仪的应用技巧二利用仪器的灵活性，充分整合项目1 1、CIKCIK细胞作用肿瘤细胞的凋亡分细胞作用肿瘤细胞的凋亡分析析2 2、不同细胞的转染、表达情况、不同细胞的转染、表达情况3 3、不同分型增殖的细胞分布、不同分型增殖的细胞分布4 4、spsp细胞、非细胞、非spsp细胞细胞 5、肿瘤细胞诊断时、肿瘤细胞诊断时 （1）、胸腹水：把白细胞和癌细胞分开）、胸腹水：把白细胞和癌细胞分开 （2）、穿刺，手术细胞：）、穿刺，手术细胞： 6、组织中

11、的浸润细胞：、组织中的浸润细胞：7、Th1/Th2细胞的分析细胞的分析四、流式细胞仪的应用技巧三 利用仪器提供的参数，对所做实验全面分析评价1、质粒转染中：、质粒转染中： 转染率转染率 疫苗疫苗 转染的强度转染的强度2、同时分析转染率和转染强度、同时分析转染率和转染强度3、稀有细胞的额外发现：、稀有细胞的额外发现： T亚期中：亚期中：CD45+、CD3+、CD4-、CD8- NK细胞：细胞：CD3-CD16+56+ CD3+CD16+56+4、Tunecl方法中方法中 不同周期的凋亡状况不同周期的凋亡状况 细胞阻滞状况细胞阻滞状况 DNA断片发生时断片发生时SOS状况状况五、流式细胞仪的应用技

12、巧四 了解相关知识及现有的评价方法，充分应用流式细胞1. 白血病分型 形态学、免疫组化、PCR2. 细胞因子 生物活性测定法、RIA和ELISA法、DNA分析法 外周血单个核细胞产生细胞因子检测法FCM、 ELI-SPOT、FCM（STAT）3. HLA B27/B7 FCM、免疫法4. 凋亡、蛋白表达 FCM、免疫组化、PCR5 . CIK、DC、CD34、CD44V、CD31等 荧光显微镜下经丫啶橙/溴化乙啶染色SGC-7901细胞24hSGC-7901蒿甲醚组24 hSGC-7901 DDP组24hECV-304细胞 24hECV-304蒿甲醚组24hECV-304 DDP组24 h六、

13、流式细胞仪的应用技巧五 专项应用中的问题及解决方案免疫细胞相对绝对计数免疫细胞相对绝对计数造血干细胞和其他稀有细胞的检测造血干细胞和其他稀有细胞的检测血小板活化、膜糖蛋白及抗体检测血小板活化、膜糖蛋白及抗体检测DNA倍体分析，周期、异倍体分析倍体分析，周期、异倍体分析细胞内因子（细胞内因子（Th1/Th2）细胞因子（体液及培养液因子）细胞因子（体液及培养液因子）各种凋亡检测（各种凋亡检测（Apo.2.7 Tunecl、DNA亚二倍体）亚二倍体）组织中免疫细胞和其他细胞（如组织中免疫细胞和其他细胞（如CXCR、CCR）基因蛋白检测（如基因蛋白检测（如p53、Bcl-2等）等）白血病免疫分型白血病

14、免疫分型B27检测检测动物检测过程中的问题动物检测过程中的问题免疫细胞的检测T细胞细胞 分群标志分群标志 活化标志活化标志 亚群标志亚群标志B细胞细胞NK细胞细胞CIK细胞细胞以T细胞亚群检测为例，其余的免疫细胞出现的问题类似1、标准方案、标准方案 抗抗 凝凝 血血 组组 织织 胸腹水、灌洗液（单细胞悬液）胸腹水、灌洗液（单细胞悬液）加入加入1ml 溶血素（溶血素（NH4Cl或或C液或液或A、B、C液）液） 上机检测上机检测 结果：结果：CD3+ T Cell ：%、Abs CD4+ T Cell ：%、Abs CD8+ T Cell ：%、AbsCD4/ CD8比值比值 2hr内加入内加入

15、100ul Flow Count （100ul/份） + 10ul 抗体标本标记 15-30 min2、可能的问题及解决办法、可能的问题及解决办法（1）、标本环节）、标本环节 抗凝血：抗凝血： A、抗凝效果不好：如果没有大的凝血块，该血可以使、抗凝效果不好：如果没有大的凝血块，该血可以使 用，但结果可能受影响。设阈值时最好采用用，但结果可能受影响。设阈值时最好采用Fl1 （CD45所在所在）;如果有大的凝血块，不能用于检测。如果有大的凝血块，不能用于检测。 B、标本在、标本在4或以下放置过：一般不做检测用。或以下放置过：一般不做检测用。 C、标本放置时间大于、标本放置时间大于48小时：检测时尽

16、量用小时：检测时尽量用Fl1设阈值。设阈值。 建议：最好使用新鲜标本检测，尤其是做绝对计数时。建议：最好使用新鲜标本检测，尤其是做绝对计数时。 D、动物血：对于猪、猴、兔、狗等大动物的，如人一样、动物血：对于猪、猴、兔、狗等大动物的，如人一样 处理。而如小白鼠等小动物，由于所采血量少，需要处理。而如小白鼠等小动物，由于所采血量少，需要 先溶血，后加样处理。如需做绝对计数，则要求计算先溶血，后加样处理。如需做绝对计数，则要求计算 稀释倍数，比如稀释倍数，比如10ul血加入血加入490ul溶血素相当于稀释了溶血素相当于稀释了 350倍。倍。2、可能的问题及解决办法、可能的问题及解决办法组织标本：组

17、织标本： 组织标本做免疫细胞时，通常需要组织标本做免疫细胞时，通常需要CD45设行设行，这样可排，这样可排 除非血细胞。除非血细胞。A、组织标本通常不需要研磨，只需用针头反复捣碎便可：、组织标本通常不需要研磨，只需用针头反复捣碎便可：这样可以减少组织细胞的量。这样可以减少组织细胞的量。B、穿刺细胞：手术标本需要反复清洗表面附有的血液，、穿刺细胞：手术标本需要反复清洗表面附有的血液，否则会影响检测结果。否则会影响检测结果。C、组织标本一般保存在生理盐水中。、组织标本一般保存在生理盐水中。2、可能的问题及解决办法、可能的问题及解决办法胸腹水、灌洗液胸腹水、灌洗液： 通常也需要通常也需要CD45设门

18、设门A、都需要浓缩处理：一般取、都需要浓缩处理：一般取250ml左右，静置左右，静置4hr后取沉后取沉淀物离心。淀物离心。B、如果需要计数，则需做体积换算，比如、如果需要计数，则需做体积换算，比如250ml500ul，相当于浓缩了，相当于浓缩了500倍。倍。组织、胸腹水标本，希望做2次过滤，第一次为标记前，采用200目过滤，第二次为上机检测前，采用300目过滤。2、可能的问题及解决办法、可能的问题及解决办法（2）、抗体环节）、抗体环节试剂选择试剂选择A、尽量选择试剂组合多的作为标记抗体，比如、尽量选择试剂组合多的作为标记抗体，比如T亚群亚群CD45/CD4/CD3/CD8：最佳选择最佳选择CD

19、4/CD8/CD3： 可用，但做起来会有很多麻烦可用，但做起来会有很多麻烦单一抗体：单一抗体： 不可用不可用 2、可能的问题及解决办法、可能的问题及解决办法B、选择试剂时，不但需要选择阳性标记，同时也需要选、选择试剂时，不但需要选择阳性标记，同时也需要选择阴性标记。择阴性标记。比如：比如：CD4T 细胞细胞CD45+CD3+CD4+CD8- B 细胞细胞CD19+CD3- NK 细胞细胞CD3-CD16+56+ CD34+ 细胞细胞CD34+CD38-尤其在科研项目中，一般应选择尤其在科研项目中，一般应选择2-3个阳性标记，同时选个阳性标记，同时选择择1-2个阴性标记，否则所做出来的结果将会有

20、很大误差。个阴性标记，否则所做出来的结果将会有很大误差。2、可能的问题及解决办法、可能的问题及解决办法C、在医学中，一般标记抗原较弱的，需选择较强的染料，、在医学中，一般标记抗原较弱的，需选择较强的染料，尤其我们在做稀有细胞的时候，比如尤其我们在做稀有细胞的时候，比如DC细胞，细胞，CD34细胞，细胞，CIK细胞，间充质干细胞等，一般均选择标记细胞，间充质干细胞等，一般均选择标记PE细胞。细胞。标记条件：一般18 25，如果温度低或高效果都不好标记时间：根据所用试剂量决定，一般不得低于15 min。2、可能的问题及解决办法、可能的问题及解决办法标记的先后顺序标记的先后顺序 A、先标记膜表面的，

21、后标记胞浆内、先标记膜表面的，后标记胞浆内 B、先处理、先处理抗体抗体，后加染料，后加染料 C、透膜处理后的标本不能强烈振荡。、透膜处理后的标本不能强烈振荡。2、可能的问题及解决办法、可能的问题及解决办法 溶血环节溶血环节溶血素的选择溶血素的选择 A、A B 液（主要是甲酸成分），一般需要专门的制备仪液（主要是甲酸成分），一般需要专门的制备仪 C B、NH4Cl（主要成分是（主要成分是NH4Cl 、NH4HCO3、EDTA ） C、溶血素、溶血素C（专配试剂）（专配试剂）2、可能的问题及解决办法、可能的问题及解决办法 自配溶血素要求：自配溶血素要求： A、必须在仪器试验后方可使用、必须在仪器试

22、验后方可使用 B、有条件时需做、有条件时需做pH、微粒分析、微粒分析 C、放置时间不宜过长，尤其是、放置时间不宜过长，尤其是A液液2、可能的问题及解决办法、可能的问题及解决办法溶血液加入溶血液加入可能出现的问题可能出现的问题 溶血效果不好溶血效果不好v 温度问题：温度问题：C液溶血和温度关联较大，一般不能放液溶血和温度关联较大，一般不能放 4冰冰 箱，可以采用水浴箱，可以采用水浴 37 v 溶血剂不够：可以离心后追加溶血剂溶血剂不够：可以离心后追加溶血剂 以上处理如果还不可以，则需要选择：以上处理如果还不可以，则需要选择：不重要的标本不重要的标本：重新再标记：重新再标记重要而又没有剩余的标本重

23、要而又没有剩余的标本：反复离心，选择：反复离心，选择1200-2000转左转左右的速度，建议每次离心均加入右的速度，建议每次离心均加入2-3mlNH4Cl溶血素。溶血素。有些抗体或染料对酸比较敏感：有些抗体或染料对酸比较敏感：比如比如PE标记，溶血后会使其脱离，但这种现象是可逆的，静标记，溶血后会使其脱离，但这种现象是可逆的，静置置10 -30 min2、可能的问题及解决办法、可能的问题及解决办法加入加入Flowcout环节环节 Flowcout必须在加入溶血素后才能加入，否则会影响检测必须在加入溶血素后才能加入，否则会影响检测结果，同时加入结果，同时加入Flowcout后后 2 hr 后必须

24、上机检测。后必须上机检测。2、可能的问题及解决办法、可能的问题及解决办法（5）、检测出结果环节：）、检测出结果环节：A、上机前需要摇匀标本，仪器开机超过、上机前需要摇匀标本，仪器开机超过30min，Flow check 10% 2% 外电压稳定等等。外电压稳定等等。B、方案尽量采用完整方案，比如方案尽量采用完整方案，比如T亚群：亚群：由于由于Flowcout微球在所有通道上都有信号，一般选择没有使用微球在所有通道上都有信号，一般选择没有使用的荧光通道作为收集通道，如果没有剩余通道，就选择荧光较的荧光通道作为收集通道，如果没有剩余通道，就选择荧光较强的染料所在的通道强的染料所在的通道方案是实现正

25、确操作和得到正确结果的平台，建议建立方 案时尽量建立完整方案2、可能的问题及解决办法、可能的问题及解决办法C、检测结果、检测结果1）、检测结果必须严格按医学含义得到，比如）、检测结果必须严格按医学含义得到，比如 CD4+T细胞细胞CD45+CD3+CD4+CD8-(百姓定义上的结果百姓定义上的结果) (医学定义上的结果医学定义上的结果) 2、可能的问题及解决办法、可能的问题及解决办法2）、相对计数：一般医院检测）、相对计数：一般医院检测T亚群时可以只做相对数，这亚群时可以只做相对数，这样就可以样就可以使用使用prism门，门，CD3+%、CD4+%、CD8+ %，如果需如果需要浓度，则从血常规

26、中得到要浓度，则从血常规中得到 淋巴细胞淋巴细胞的浓度的浓度 * 相应的相应的 % = 浓浓度（即所谓度（即所谓的的 双平台法双平台法），这时我们可以采用缩小设行的办），这时我们可以采用缩小设行的办法，得到准确的法，得到准确的%。3）、绝对计数：）、绝对计数：AIDS往往采用单平台法得到浓度，这样我们往往采用单平台法得到浓度，这样我们可以采用扩大设行方法得到准确的绝对数。可以采用扩大设行方法得到准确的绝对数。2、可能的问题及解决办法、可能的问题及解决办法3）、影响结果的因素：）、影响结果的因素： 电压、补偿不足或过头均影响电压、补偿不足或过头均影响 阈值设置不合理阈值设置不合理 设门设门范围范

27、围 FlowcoutDNA检测1、固定问题：、固定问题：70%酒精酒精 106 细胞细胞 700 ul 冰乙醇冰乙醇2-3min2-3min300 ul 蒸馏水蒸馏水4-72 hr2、离心：、离心：1500转转3、透膜：、透膜： triton x -100 （intra 1、intra 2）细胞因子的检测1、解决干扰碎片、解决干扰碎片（1）、）、-20静置，静置，24hr（2）、）、4500转，离心转，离心2、强度问题：外延浓度、强度问题：外延浓度 0、5、10、20Capture BeadsCapture BeadsLysate SampleLysate SampleDetector Ant

28、ibodiesDetector AntibodiesWashWashAnalyze on Analyze on flow flow cytometercytometer多种细胞因子FCM（STAT）的原理Color-coded MicrospheresFL4Main MenuDifferentiation of 10 Populations*Human Th1/Th2 Cytokine I KitFL2 (Reporter Parameter)FL4(Differentiator Parameter)Main MenuHLA-B27 检测中的问题 利用B27 荧光强度判定的阳性率很低。 原因：

29、 通常B27的判定标准是荧光强度大于8 ，但这个标准是在加全量抗体的条件下做的，而目前大多数用户只加半量或1/4量做，导致荧光强度降低。 解决方法： 1 加全量抗体。 2 判定标准改为用阳性率大于90%。ANNEXIN V/PI检测凋亡的问题 结果偏低 原因：1 没有用试剂配套的连接缓冲液。 2 消化贴壁细胞时用胰酶。 解决方法：1 消化细胞时不要用胰酶，要用EDTA，用配套的缓冲液。PNH检测的问题 粒细胞上CD55，CD59检测结果偏低，而在红细胞上正常。 原因：在进行抗体染色之前，没有进行溶血，导致了抗体先和红细胞结合，而无法与白细胞充分反应，产生了阴性结果。 解决方法：在染色之前，先进行溶血洗涤，然后再染色。