应用彗星试验检测细胞DNA损伤的原理与方法

1、#综述 #应用彗星试验检测细胞 DN A 损伤的原理与方法 肖琳 1王松 1王凡 2(1武汉体育学 院解剖教研室 武汉 430079; 2四川大学华西医学中心人体解剖学教研室 成都 610041 =中图分类号 >Q 523=文献标识码 >A环境中多种因素 , 包括物理的如电离辐射和紫外 线 (U V , 化学的如多种氧化剂及三氯乙烷、 丙烯酰 氨等 , 以及混合性因素如老化、 吸烟等均可直接或间 接造 成 DNA 链 的 断 裂 1, 2(sing le str and break, SSB 。虽然 DNA 单链断裂不 会影响长链 DNA 分 子的连续性 , 但双链 断裂 则会造

2、成 DNA 片段 的移 位、 异位、 丢失等 , 从而引起遗传性的损伤并影响遗传 行为 3。检测 DNA 链的断裂是测定 DNA 损伤程度 的有效技术。近年来由 Singh 等 4在 Osting 和 Jo -hanson 5最先提出应用中性微胶电泳技术的基础上 改进和建立的彗星试验 (comet assay 即单细胞凝胶 电泳试验 (single cell g el electr ophoresis SCGE 是检 测单个细胞 DNA 链 断裂的 新技术 , 该方 法具 有灵 敏、 简便、 快速及样品用量少、 不需放射性等优点 , 已 广泛应用于放射生物学、 DNA 损伤与修复、 DNA 交

3、 联、 内源性自由基攻击所致的 DNA 氧化性损 伤、 遗 传毒理学、 肿瘤 治疗 评 价及 细 胞凋 亡 等 领域 的 研 究 6。它也已用于职业医学 , 如评价职业有害因素对 DNA 的损伤 , 做为职业人群的生物学指标等 7。 目前国内外学者在这方面进行了大量的研究 , 本 文旨在通过相关文献的综述 , 介绍其原理与方法 , 以 便在国内进行更大的推广。1SCGE 测定原理哺乳类细胞和人血淋巴细胞 , 其 DN A 的分子量 很高且具有严密的超螺旋结构。在理想的实验条件 下对淋巴细胞的分离、 处埋、 裂解、 碱处理等过程均保 持在避光条件下小心谨慎地操作 , 使细胞 DNA 不受 损伤

4、, 其 DNA 结构仍象在活细胞中那样完整 , 外加 电泳电场就不会使 DNA 在凝胶中泳动。因此 , 在理 想条件下 , 正常对照组细胞 DN A 在电泳之后仍应保 持在原来位置。在 SCGE 实验中 , 细胞 DNA 之所以 从原位向电泳电场的阳极迁移 , 形成彗星图象 , 其原 因是 :当细胞 DNA 受损伤产生链断裂时 , DNA 的超 螺旋结构受到破坏 ; 在细胞裂解液作用下 , 细胞膜、 核 膜及其它膜结构受到破坏 , 细胞内的蛋白质、 RNA 及 其它成分 均 可进 入 凝胶 而 扩散 到 裂解 液 中 , 而 核 , 碱处理和碱性电解液作用下 DNA 解螺旋 , 使 DNA 的

5、断链和碱易变性 DNA 片段从严密的超螺 旋结构 中释放出来 ; 由于这些 DNA 片段分子量很小且碱变 性为单链 , 所以在电泳电场中就可以离开核 DNA 在 凝胶分子筛中向阳极移 动 , 形成彗星状图象。 DNA 受损伤越严重 , 产生的断链和碱易变性片段就越多 , 断链也越小 ; 在相同电泳条件下迁移的 DNA 量就越 多 , 迁移的距离就越长 . 因此 , 通过测定 DNA 损伤迁 移部分的光密度或迁移长度就可定量测定 DNA 损 伤程度 , 确定电离辐射或其它因素作用剂量与 DNA 损伤效应之间的关系 .2SCGE 测定方法211细胞分离和处理 (1 人血淋巴细胞分 离 :从健康人静

6、脉采血 0. 95-1ml, 沿离心管管壁滴 加在等体积淋巴细胞分离液液面上 , 3500r/m in 离心 2min, 吸取中间层淋巴细胞于 10ml 离心管中 , 加磷 酸盐缓冲液 (PBS 至 5m l, 1500r/m in 离 心 8min, 如 此重复洗涤细胞两次 , 再将细胞悬于 PBS, 置 4e 待 用。 (2 其它细胞的分离制备 :对于体外培养的细胞 株 , 若为贴壁生长的细胞 , 当细胞处于对数生长期时 , 可弃去旧培养液 , 加适量 0. 1%胰蛋白酶 H ank . s 溶 液 , 在 37e 下 3-5m in 使细胞脱离瓶壁 , 用 PBS 洗涤 细胞 2-3次

7、, 调节至适当的细胞密度即可 ; 若为悬浮 培养的细胞 , 只需用 PBS 洗涤细胞两次即可。对于 实体肿瘤细胞、 胸腺、 脾及其它组织 , 可用不锈钢剪去 除结缔组 织 , 剪碎 , 压研通 过 60目不 锈钢 网 , 再 用 PBS 洗涤细胞 2-3次 , 调节至适当细胞密度即可。 对于肝细胞的分离制备比较复杂 , 需经过含胶原酶和 透明质酸酶的缓冲液进行器官灌注 , 再分离肝细胞。 (3 紫外线或 C -线照射 :取新鲜分离的淋巴细胞或 其它细胞悬液 , 用 PBS 调细胞密度为 2105个细胞 / m l 。于冰水浴中经紫外线或 60Co -C 照射 , 照后细胞 置于冰水浴中 , 并

8、立即用于 SCGE 测定。 (4 化学处 理 :新鲜分离的淋巴细胞或其它细胞 , 在 SCGE 测定 前用待测化学物在 37e 下处理 24h, 细胞密度均为 2105个细胞 /m l 。然后将细胞保存在 4e 下或冰水 ,#40#SICHUAN JOURNAL O F ANATO MY VO L. 12NO . 12005212制片 (1 磨沙载玻片 :用水砂纸 (粒度 , NO. 380 将普通光学显微镜用的载玻片 (厚度较薄为 宜 单面加水轻磨 , 使形成的磨沙面均匀细密。磨时 谨防加压过大、 用力过猛 , 以免在载玻片面上形成粗 纹痕迹。 (2 制胶 板 :第 一层 胶的 制 备 ,

9、在 37e 将 110L l 0. 5%的正常熔点琼脂糖 (NM A 浇注到磨砂 的经玻片上 , 迅速盖上盖玻片 , 使胶均匀展开 , 置 4e 10m in 固化。第二层胶的制备 :轻取下盖玻片 , 取 0. 1ml 浓度为 2105/ml 的细胞悬液加入 0. 9m l 37e 0. 7%的低熔点琼脂糖 (LM P 中 , 混匀后迅速取 75L l 加到第一层胶上 , 立即盖 上另一干 净的盖玻 片 , 置 4e 10min 使琼脂糖固化。第三层胶的制备 :取下盖 玻片 , 取 75L l LM P 铺 在第二层 胶上 , 盖上盖玻 片 , 4e 10min 固化。 (3 裂解 :取下盖玻

10、片 , 将载玻片浸 没于 新 配 制 的 裂 解 液 (2. 5mo l/LNacl, 100m mol/ LN a 2EDTA, 10m ol/Ltris, 1%肌 氨酸 钠 , 用 前加 入 1%T iton X-100, 10%DM SO, 最后用 N aOH 溶液 调 pH 为 10 中 , 这一处理可使细胞膜、 核膜及其它 生物膜破坏细胞内的蛋白质、 RN A 及其它成分扩散 出胶进入裂解液中 , 只有细胞 DNA 由于它的高分子 量和超螺旋结构 , 仍保持在原处 , 对于正常的未处理 的细胞其 DNA 结构在理想条件下 仍应象在细胞中 那样。 (4 解旋 :从裂解液中取出载玻片 ,

11、 在蒸馏水中 洗去过多的盐 , 晾干后置于水平电泳槽中 , 将新配置 的电 泳 缓 冲 液 (1mmo l/LN a 2EDTA 和 300m mol/ LN aOH , pH 为 13 倒入电泳槽中 , 液面高于载玻片 0. 25cm, 盖上盖子 , 避光静置 30m in, 使 DNA 解旋。 (5 电泳 :调整缓冲液液面高度 , 使电压为 25V 电流 为 300mA, 室温下电泳 30分钟。目的是使 DNA 片 段向阳极迁移。 (6 漂洗及染色 :电泳完毕 , 取出载玻 片 , 用 0. 4m mol/Ltris-H CL(pH 为 7. 5 浸没载波 片漂洗 15min, 重复三次

12、, 用滤纸将缓冲液吸干 , 后缓 缓加入无水乙醇将凝胶浸埋 1h 。之后 , 吸去乙醇 , 晾 干或室温下过夜。每凝胶滴加 30L l 50L g/m l 的溴化 化乙锭 (EB 水溶液 , 盖上盖玻片染 色 20min 。以上 步骤尽量在黄光或暗处进行 , 避免其它原因 所致的 DNA 损伤。整个实验至少重复 3次 , 每个浓度至少 作两张片子。2. 3观察和拍照 将载玻片编为盲片 , 然后 置荧光显微镜下 , 使用 515-560mn 的激发波 , 放大 倍数为 1020倍 , 并装上 400锭 135黑白胶卷进行 同步照像。每张片子随机观察 30个细胞 , 计出拖尾 细胞数 , 同时用目

13、镜测微尺测量每个观察细胞的头长 和全长 , 全长减去头长即为彗星尾长。有条件者可借3SCGE 结果分析在荧光显微镜下 , DNA 被 EB 染成桔红色 , 未受 损细胞表现为一 圆形荧光核心 , 即彗星 头部 , 无尾。 而受损细胞则有彗星尾从核中伸向阳极 , 形成一个亮 的荧光头部和尾部。有人认为其彗星尾与 SSB 数目 相关 4, 但当剂量加大时 , 尾中荧光强度更能反应断 裂频数 8。 Oliv e 等 9报 道 , 断 裂 DNA 数目变 化 4倍时 , 其尾长 仅变化 21%, 而 荧光 强度几 乎增加 一 倍。 Vijayalax mi 10等认为 DNA 损伤程度直接与辐 射剂量

14、、 碱接触时间、 电泳长度有关 , 因此将尾长作指 标具有一定的价值 , 分析方法主要是对显微负片进行 测量 , 如彗星长度、 头直径、 面积 , 也可测其斜度和峭 度 , 以辨别不同受试物 , 如 U V, X 线等均可引起不同 的彗星形状 , 还可用自动数字图象处理系统 , 它能提 供全范围密度及几何参数 , 描述彗星整体和头尾各部 的特征。在统计时由于它不属于正态和但模型分布 , 故不宜用参数或非参数检测 , 而应用响应或非响应混 合评价 (即用 Lehman 转换打分方法 , 因它是强行设 定界限值 , 将结果分 为阴性或阳性。如果要得 到剂 量 反应关系 , 不宜用彗星长度 , 而最

15、好用面积或尾 部荧光强度做判断。4影响 SCGE 分析的因素411受试物 、 DN A 损伤与修复有些受试物 , 如 60Co 、 X 射线等在接触的 早期直 接引起 DNA 断裂 , 并且大 多数在 15m in 内得到 修 复 ; 而有些 受试 物 , 如 U V, 则 多在 照射 后 1h 引 起 DNA 断裂达到最高峰 11。在修复方面 , 各种细胞中 也有差异 , 如 SCGE 可揭 示肿瘤细胞 PECA4197与 M eWo 对放射损 伤的差异不是源于 损伤 , 而是 肿瘤 细胞 PECA4197的修复比 MeWo 快的多 12; 不同细 胞对 SCGE 敏感性不同 , 如肝细 胞

16、在彗星实验 中的 敏感性明显高于脾和肾细胞 13。4. 2细胞周期一般认为 , 细胞 处于不同周期对 SCGE 的 敏感 性有影响 , 无 论在中 性或 碱性 SCGE 中都 是如此。 如 S 相细胞 DNA 比其它相 DN A 表现的损伤轻 , 这 可能是由于 DNA 结构差异 , 复制时的 DNA 在电场 中迁移变慢所致 , 另外可能还有其它因素影响断裂的 DNA 从胞核中迁移出 9。5SCGE 的应用前景SCGE 已被用于检测受试物对哺乳类细胞 DNA 损伤和修复的各种体内外试验 4, 5, 9, 其检测 DNA 断 裂的特性 使它 能广泛 地用于 各种理 化因素 诱导 的 DNA 损伤

17、与修复的研究 ; 作为生物标记进行生物检 # 41 #四川解剖学杂志 2005年第 12卷 第 1期的研究。彗星试验在 DNA 切除修复研究中尤其有用 , 而 切除修复在人类 DNA 损伤修复中占主要地位 , 利用 它可以进行从损伤到切除修复、 合成、 连接的单步骤 各时点的观察 ; 同时 , 除完整细胞外 , 它可用于渗透性 细胞的研究 , 因后者的的核对外来蛋白、 抑制物、 脱氧 核糖核酸等 渗透 , 可 用于 DNA 修 复的分 子机 理探 讨 8。 Green 等 11报道 , SCGE 可能是干 皮病 (XP 快速诊断的好办法 , 并可 在修复缺陷型细胞 中研究 DNA 的损伤与修复

18、。在流行 病学研究中 , 人们越来 越重视生物学标 记 , 血红蛋白和 DNA 加合物、 DNA 损伤 (碱性和中 性凝胶洗脱 和人类淋巴细胞遗传学 (染色体畸变分 析、 微核试验 都已被用做生物学标记 14, 可是 , DNA 加合物的检测不能提供 DNA 损伤 在各种细胞的分 布 15; 所用到的生化方法不能提供单个细胞中 DNA 损伤情况 ; 细胞遗传学方法不能用于单个细胞水平 , 且往往限于增殖细胞 , 尤其是外周淋巴细胞 16。而 SCGE 技术则超越了这些方面 , 而且相对简便、 快速 , 对各种理化因素都较敏感 , 需样品量少 , 适合于各种 细胞类型的体内外检测 , 花费少 ,

19、 因此非常适合于接 触遗传性有害因素人群的生物监测 , 并可用于筛检对 DNA 损伤因素敏感的高危人群。值得注意的是 , 有 人报道用淋巴细胞做的 SCGE 可能会存在个体内和 个体间差异 , 其它非淋巴细胞则变异很小 17。 SCGE 实验不止 适用于 人类 细胞 , 它还 适用 于植 物、 动 物 DNA 损伤的监测。SCGE 是一种评价遗传毒理性损害非常敏感的 系统 , 可在组织培养及悬 浮培养的原代细胞 中进行 DNA 损伤诱导 , 且在体内及离体均可检测 , 以探讨已 知遗传性毒物和致突变物的特异活性 , 包括体外细胞 特异代谢活性和 DNA 修复 , 体内相关途径给予化合 物的代谢

20、动力学和剂量 反应关系 , 以及某些未知化 合物的遗传毒性。在肿瘤治疗中有一个重要问题 , 那就是肿瘤细胞 和正常细胞对理化治疗所导致 DNA 损伤的修复能 力 , 如果肿瘤细胞的修复能力强 , 则意味着治疗的失 败 ; 如果正常细胞的修复能力低 , 则增大了治疗的危 险性 , 治疗方案的制定一直是医学家的难题 12。在 SCGE 出现之前 , 一直没有较好的方法在确定低剂量 治疗时细胞个体的修复能力。 SCGE 的出现使人们 得到了一个有效的评价方法 9。它可以检测 2Gy 以 下照射时细胞的损伤与修复 , 并被认为是低剂量辐射 (0. 5Gy 时快速灵敏的检测方法 10。鉴于 SCGE 的

21、 诸多优点及其广泛应用前景 , 相信不久在国内会得以 更大的推广。参考文献112H an n A. Assessment of DNA damage in filamentou s fun gi b y sin -gle cell gel electrophoresis, comet assay J . Environ T ox icol Ch em, 1999, 18:14211-1424122Oollga K. Plants ex periencing ch ronic internal ex posure to ion izing radiation ex hibit h igh fre

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