异丙嗪对家兔EGTA性发热的解热作用及其机制研究

1、异丙嗪对家兔EGTA性发热的解热作用及其机制研究摘要目的：观察异丙嗪(promethazine,PMZ)对家兔EGTA性发热的影响并探讨其作用机制。方法：侧脑室和静脉给药。用Fura2荧光分光光度法测定细胞内游离钙浓度(Ca2i)。结果：(1)侧脑室灌注0.6 mol EGTA引起家兔明显的发热反应，侧脑室灌注0.6 mol EGTA 20 min 后，静脉注射PMZ(5 mg/kg)明显抑制EGTA引起的结肠温度上升，其3 h发热反应指数明显低于侧脑室灌注0.6 mol EGTA 20 min后静脉注射生理盐水(NS)组。而侧脑室灌注人工脑脊液(ACSF)20 min后静脉注射PMZ(5 m

2、g/kg)组家兔结肠温度明显低于ACSFNS对照组。(2)体外实验发现，向下丘脑细胞悬液中加入终浓度为0.74 mmol/L的PMZ，下丘脑细胞Ca2i从(159.218.8)nmol/L升高到(533.790.1)nmol/L(P0.05)。 结论：PMZ诱导体温调节中枢神经细胞Ca2i升高可能是PMZ抑制家兔EGTA性发热的中枢机制之一。主题词依他酸；发热；钙；异丙嗪 The antipyretic effect of promethazine on egtazic acid-induced fever in rabbitsWANG Yan-Ping,WANG Hua-Dong,LU Da

3、-Xiang,CHEN Xiao-Lin,LI Chu-Jie,YAN LiangDept.of Pathophysiology,Jinan University Medical College,Guangzhou(510632)AbstractAIM：To investigate the effect of promethazine(PMZ)on egtazic acid-induced fever in rabbits and its mechanism.METHODS:Egtazic acid was administrated intracerebroventricularly,PMZ

4、 was given intravenously.Free Ca2 intracellular concentrations(Ca2i)was measured by Fura-2 fluorometry.RESULTS:(1)0.06 mol egtazic acid intracerebroventricularly infused induced a rise in colonic temperature,when PMZ(5 mg/kg) was administrated intravenously 20 min after the infusion of egtazic acid,

5、it reduced the febrile responses of rabbits to egtazic acid significantly (0.06 mol) but without complete suppression.PMZ administrated alone caused a marked decrease in colonic temperature.(2)PMZ (0.74 mmol/L) increased Ca2i in hypothalamus cells from(159.218.8)nmol/L to(533.790.1)nmol/L (P0.05).CO

6、NCLUSION：PMZ possesses antipyretic effect on egtazic acid-induced fever in the rabbit and raises the possibility that the antipyretic actions of PMZ are mediated through the increase of Ca2i incuced by PMZ.MeSHEgtazic acid;Fever;Calcium;Promethazine组胺H1受体阻断剂异丙嗪(promethazine,PMZ)是一种常用的抗过敏药物，它具有降低正常体温

7、和抑制家兔内毒素性发热的作用1，2，但其降温机制尚不清楚。一些学者强调Ca2浓度是体温调定点的生理学基础，并认为其敏感区位于后下丘脑3。我们的研究发现4，向家兔侧脑室灌注EGTA，降低中枢Ca2浓度，可引起家兔明显的发热反应。然而，异丙嗪对家兔EGTA性发热有何影响?其降温机制是否与中枢钙代谢有关?迄今未见文献报道。因此，本研究旨在观察PMZ对家兔EGTA性发热反应及家兔下丘脑细胞Ca2i的影响。材料与方法一、试验试剂和主要仪器：人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)按文献方法配制4。EGTA(ethylene glycol bis(2-amino

8、thyl-ether)tetraacetic acid)，分析纯，美国Feinbiochemica Heidelberg公司产品，实验时用ACSF配制成4 mmol/L(pH 7.4)。胰蛋白酶、Fura2AM(用DMSO溶成1 mmol/L后，置20 避光保存备用)、Triton X100、trypan blue、盐酸异丙嗪均为美国Sigma公司产品；DMEM培养基购于美国Gibco公司。其它试剂均为国产分析纯。主要仪器有RF5000型荧光分光光度计(日本 Shimadzu)、3000型二氧化碳培养箱(美国Sheldon)、HL2型电子微量恒流泵(上海沪西仪器厂)和WRYB型微机热原测温仪(

9、上海黄海仪器厂)。二、实验动物：健康封闭群新西兰兔20只由本院动物所提供，体重2.02.7 kg，雌雄不拘，单笼饲养，自由饮水进食。实验室温度保持在2123 。实验前，家兔置于特制的兔架上，用模拟测温探头的导管经肛门插入10 cm并固定在尾根部，每天4 h，适应3 d，第4 d开始实验。三、体温测定：实验时，将测温探头经肛门插入10 cm并固定在尾根部，待体温稳定后，用与测温探头相连的WRYB型微机热原测温仪测定家兔结肠温度3次(每10 min 1次)，取均数作为基础体温，侧脑室灌注后每10 min测定家兔结肠温度1次，连续观察3 h。四、侧脑室插管：参照文献所描述的方法4，5，在兔头颅骨AP

10、O L45，APO R45处钻孔，将外径为1 mm的塑料导管插入H5水平，用牙科粘固粉将塑料导管固定在颅骨上，并加热封闭塑料导管的上端，缝合切口，术后肌注青霉素(2万U/kg)3 d。第6 d挑选健康的家兔在清醒的情况下进行侧脑室灌注实验。五、下丘脑细胞Ca2i测定：(一)下丘脑细胞悬液制备及Frua2AM负载：参照文献所述的方法4，6，迅速断头处死家兔，取下丘脑组织置冰冷的Hepes缓冲的Hanks液(mmol/L：Hepes 20,NaCl 137，KCl 5.0，KH2PO4 0.4,Na2HPO4 0.6，NaHCO3 3.0，CaCl2 1.3，MgSO4 0.4，MgCl2 0.5

11、 ，glucose 5.6；pH7.4)中除去血管和残留血液，转入含0.5 mL冰冷Hepes缓冲的Hanks液的烧杯中剪碎后再移入试管，加适量0.125%的胰酶，置37培养箱中20 min。用0.5 mL冰冷的DMEM培养基(含10%小牛血清)终止消化，经200目过筛后1500 rmin 离心5 min，去上清液，沉淀用DMEM培养基悬浮。取少量的细胞悬液用台盼蓝(trypan blue)拒染实验检测细胞存活率在95%以上，调整细胞密度为1109个L。在上述细胞悬液中加入Fura2AM(终浓度为5 mol/L)后，将细胞悬液置于5%CO2培养箱中，在37 恒温下孵育50 min。负载后的细胞

12、用Hepes缓冲的Hanks液洗3次。用2.5 mL Hepes缓冲的Hanks 液悬浮细胞备用。(二)荧光测定6：采用RF5000型荧光分光光度计，其激发光栅为5 nm，发射光栅为10 nm。首先扫描测定Fura2AM标准液、负载液及Fura2AM与细胞悬液温育后的细胞悬液的荧光光谱。Fura2AM进入细胞水解成Fura2后与Ca2结合，其激发波长从380 nm移至340 nm左右，发射波长仍为500 nm。达到上述要求后，观察不同实验条件下荧光强度的变化，用计算机按下式计算Ca2i：Ca2ik（d）（FFmin)（FmaxF）。其中，k（d）为Fura2与Ca2反应的解离常数(224 nm

13、ol/L)；F为不同实验条件下的荧光值，Fmin为最小荧光值；Fmax为最大荧光值。实验时，先测定静息状态下和加入各种影响因素后的F值，然后加入浓度为0.1% Triton X100 测定Fmax，加入终浓度为4 mmol/L EGTA测定Fmin。并在计算前对细胞自发荧光的影响进行校正。六、实验步骤和分组：(一)用18只家兔进行在体实验，观察PMZ对家兔EGTA性发热的影响。家兔随机分4组：ACSFNS组、ACSFPMZ组、EGTANS组和EGTAPMZ组，实验时，用HL2型电子微量恒流泵向侧脑室灌注ACSF150 L或EGTA(4 mmol/L)150 L，20 min后，经兔耳缘静脉注射

14、PMZ 1 mLkg(5 gL)或生理盐水(normal Saline,NS)1 mL/kg。(二)用2只家兔制备下丘脑细胞悬液，观察PMZ对下丘脑细胞Ca2i的影响七、体温反应指标及数据处理：体温反应指标用平均体温反应曲线，3 h发热反应指数(3 h thermal response index,TRI3结果一、PMZ对家兔EGTA性发热的影响：如1和表1所示，侧脑室灌注ACSF，20 min后静脉注射生理盐水组，家兔体温没有明显的改变。而ACSFPMZ组家兔体温明显下降。EGTANS组TRI3明显高于ACSFNS组(P0.05)。侧脑室灌注0.6 mol EGTA20 min后静脉注射PM

15、Z(5 mg/kg)组TRI3明显低于EGTANS组(P0.05)。表1各组家兔3 h发热反应指数Tab 1Three-hours thermal response index(TRI3GroupnTRI3ACSFNS30.881.27ACSFPMZ47.335.48*EGTANS620.586.43*EGTAPMZ56.721.45* ?*P0.05,vs ACSFNS group；P0.05，vs EGTANSgroup Fig 1Effect of promethazine(iv) on the EGTAinduced fever in rabbits1静脉注射PMZ对家兔EGTA性发热

16、反应的影响 二、PMZ对家兔下丘脑细胞Ca2i的影响：实验发现，向下丘脑细胞悬液中加入50 mmol/L KCl，细胞Ca2i从(107.74.6)nmol/L 升高到(194.110.3)nmol/L(P0.05)。如2所示，向下丘脑细胞悬液中加入2 mol的PMZ(终浓度为0.74 mmol/L)，引起Fura2负载的下丘脑细胞荧光比率(340 nm380 nm)明显上升，显示PMZ引起下丘脑细胞Ca2i明显增高，下丘脑细胞Ca2i从(159.218.8)nmol/L升高到(533.790.1)nmol/L(P0.05)。讨论Palmi等观察到侧脑室注射钙通道阻断剂异搏定和nifedipi

17、ne引起家兔体温明显升高，事先给予乙酰水杨酸明显抑制异搏定诱导的这种升温反应，与此相反，侧脑室注射钙通道激动剂BAYK8644却引起家兔体温明显降低。提示钙通道阻断剂的作用部位是体温调节中枢的神经元，这些神经元的体温调节功能与钙代谢密切相关7。我们先前的研究表明4，侧脑室灌注EGTA络合中枢Ca2进而降低下丘脑神经细胞Ca2i导致下丘脑cAMP增高是家兔EGTA性发热的中枢机制。本研究发现，静脉注射PMZ能明显抑制家兔EGTA性发热，而且体外实验进一步观察到，PMZ可引起下丘脑细胞Ca2i明显增高，结合先前的研究4，7，这些结果提示PMZ诱导体温调节中枢神经细胞Ca2i增高可能是PMZ抑制家兔

18、EGTA性发热的中枢机制之一。Palmi等曾报道7，侧脑室注射钙通道激动剂BAYK8644不仅可降低家兔正常体温，而且抑制家兔ET性发热。如前所述，PMZ可引起家兔下丘脑细胞Ca2i明显增高，而且具有降低正常体温和抑制ET性发热的作用，因此我们推测，PMZ抑制ET性发热的机制也可能与PMZ诱导体温调节中枢神经细胞Ca2i增高有关。新近，Tanaka等发现8。PMZ可阻断心肌细胞Na内流，PMZ对体温调节中枢神经细胞是否有这种作用，有待进一步验证。作者单位：暨南大学医学院病理生理教研室(广州510632)参考文献2i、cAMP在家兔EGTA性发热机制中的作用.中国病理生理杂志，1996，12：402.5Sawyer CH,Everett JW,Green JD.The rabbit diancenphalon in stereotaxic coordinates.J Comp Neuron,1954,101:801.6Dildy JE,Leslie SW.Ethanol inhibits NMDA-induced increases in free intracellular Ca2 in dissociated cells.Brain Res,