高效液相色谱仪工作原理-电子教案

1、仪器分析教案知识点高效液相色谱仪工作原理学时2学时教学内容液相色谱流动相的选择，进样、分离柱分离原理，检测器检测原理教学重点各种不同分离柱分离原理，各种不同检测器检测原理教学难点分离柱分离原理，检测器原理参考资料Waters公司培训材料仪器分析技术，王秀萍。化学工业出版社现代仪器分析，化学工业出版社仪器分析，张威，张晓辉，中国轻工业出版社HPLC基本原理高效液相色谱法（high performance liquidchromatography, HPLC)是以高压输出的液体为流动相的色谱技术。高效液相色谱法是在经典液相色谱法的基础上，引入气相色谱的理论和实验方法而发展起来的一种分离分析方法。一

2、、高效液相色谱法的特点高效液相色谱法以经典液相色谱法为基础，但又不同于经典液相色谱法。与经典液相色谱法相比，具有如下特点：1.高效 由于使用了极细颗粒的固定相和均匀填充技术，高效液相色谱的分离效率极高，柱效可达每米105理论塔板数。2.高速 由于采用高压泵输送流动相，使流动相流速大大加快，流速最高可达10 ml/min，完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱法快得多。3.高灵敏度 紫外、荧光、电化学以及质谱等高灵敏度检测器的使用，使高效液相色谱的检测限可达10-910-11 g。4.高自动化 智能化的色谱专家系统结合自动进样装

3、置，使高效液相色谱从进样、分离、检测、数据采集、数据处理，一直到结果打印完全自动化。二、高效液相色谱法是在气相色谱法的理论和实验技术基础上发展起来的，与气相色谱法相比较，具有如下优点：1.应用范围广 高效液相色谱法与气相色谱法相比，具有应用范围更广的优点。它可用于高沸点、相对分子量大、热稳定性差的有机化合物以及各种离子的分离分析。只要把样品制成溶液便可进行分析，特别是一些生物大分子，如多肽、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、脂类、维生素等，都可用高效液相色谱法进行分析。2.选择性高 气相色谱法采用的流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即流动相和组分不发生相互作用，仅起载带作用。

4、高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，对组分有不同的亲和力，参与对组分的分配作用。流动相对分离效果影响很大，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大的方便。因此，它不仅可以利用被分离组分的极性、分子尺寸、离子交换能力以及生物分子间亲和力的差别进行分离，还可通过改变流动相的组成来改善分离效果，使得性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。3.气相色谱一般都在较高温度下进行，且对控温要求比较高，而高效液相色谱则经常在室温条件下进行，且对控温的要求也不高。4.高效液相色谱法的馏分易于收集，更有利于制备。高效液相色谱的主要缺点是：仪器比较昂贵；缺乏通用的高

5、灵敏度检测器；分析周期较长；柱和流动相的消耗成本高；有机溶剂会造成环境污染，危害操作人员的健康。三、高效液相色谱法的分类高效液相色谱法的分类与经典液相色谱法的分类相同。按固定相的物理状态可分为液-液色谱法和液-固色谱法两大类。按分离原理可分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、化学键合相色谱法以及胶束色谱法（micelle chromatography，MC)等。近年来，高效液相色谱法发展迅猛，许多新方法不断涌现，又出现了一些其它的分类方法。如根据固定相和流动相相对极性的大小，液液分配色谱法又可分为正相液液分配色谱法（normal-phase liquid-li

6、quidpartition chromatography，NLLC)和反相液液分配色谱法（reversed-phase liquid-liquid partition chromatography，RLLC)，而后者又可进一步分为普通反相液液分配色谱法、离子对色谱法（ion pair chromatography，IPC)和离子抑制色谱法（ion suppression chromatography，ISC)。四、高效液相色谱仪主要组成高效液相色谱仪主要由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统等五部分组成。高档的高效液相色谱仪还配有梯度洗脱、柱温箱及自动进样器等辅助装置。高效

7、液相色谱仪的工作流程如下：贮液器中的流动相在高压泵作用下经由进样器进入色谱柱，然后从检测器流出。待分离试样由进样器注入，流过进样器的流动相将试样带入色谱柱中进行分离，分离后的各组分依次进入检测器，检测器将被分离组分浓度的变化转变为电信号，进而由数据处理系统将数据采集、记录下来，得到色谱图。（一）高压输液系统高压输液系统一般由贮液器、脱气装置、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻尼器以及梯度洗脱装置等组成，其中高压输液泵是核心部件。1.贮液器 贮液器用来贮存流动相，其材料对流动相是化学惰性的。常用的材料为玻璃、不锈钢或表面涂聚四氟乙烯的不锈钢等。为防止长霉，贮液器中的流动相要经常更换，并经常

8、清洗贮液器。2. 过滤和脱气装置  流动相和样品溶液的过滤非常重要，以免其中的细小颗粒堵塞色谱柱、毛细管以及影响高压输液泵的正常工作。流动相在使用前应根据其性质选用不同材料的滤膜过滤，一般选用市售的0.45mm的水性和油性滤膜进行过滤，水用水性滤膜过滤，甲醇等有机溶剂用油性滤膜过滤。样品溶液一般用市售的0.45mm针形滤器过滤。另外，在流动相入口、泵前、泵和色谱柱间都配置有各种各样的滤柱和滤板。流动相进入高压泵前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体（如O2)，防止流动相由色谱柱进入检测器时因压力降低而产生气泡，增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。如果使用荧光检测器，溶解氧

9、还可能造成荧光猝灭。常用的脱气方法有：（1)低压脱气法：低压脱气法又称真空脱气法，即通过抽真空除去溶液中的气体。减压过滤，也具有除去部分气体的作用。但由于抽真空会导致溶剂的蒸发，对二元或多元流动相的组成会有影响。（2)吹氦脱气法：氦在大多数溶剂中的溶解度极低，因此用氦气鼓泡来除去流动相中溶解的气体。该法使用方便、脱气效果好，但氦气较贵。（3)超声波脱气法：将贮液器置于超声波清洗槽中，以水为介质，超声脱气。此法操作简便，为大多数用户采用，但脱气效果不理想（脱气效率约30%)。（4)在线脱气：目前，许多高档的高效液相色谱仪都配备了在线脱气装置。在线脱气装置可以连续不断地从流动相中除去溶解的气体，消

10、除流动相的不稳定因素、降低基线漂移及噪音，从而消除了氧对电化学、荧光和紫外检测的干扰。这种脱气方法，效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。3. 高压输液泵  高压输液泵（high pressure pump)的作用是提供足够恒定的高压，使流动相以稳定的流量快速通过固定相。一个好的高压输液泵应符合下列要求： 密封性好，耐腐蚀； 有足够的输出压力，使流动相能顺利通过色谱柱； 输出压力平稳，脉冲小； 输出流量恒定，可调范围宽； 泵室体积小（0.5 ml)，易于清洗，便于迅速更换溶剂。高压输液泵按输液性质可分为恒压泵和恒流泵两种。按工作方式又可分为隔膜泵、气动放大泵、螺旋注射泵和往

11、复柱塞泵。其中，隔膜泵和气动放大泵为恒压泵，螺旋注射泵和往复柱塞泵为恒流泵。恒压泵的特点是：在操作过程中保持输出压力恒定，但其流量随色谱系统阻力变化而变化。恒流泵的特点是：在一定的操作条件下，输出的流量保持恒定，不受色谱柱阻力和流动相黏度等变化的影响。目前高效液相色谱仪广泛采用的是柱塞往复泵。这种泵的泵室体积小，一般只有几毫升，易于清洗和更换溶剂，适合于梯度洗脱操作。缺点是输出液流脉动大，需要外加脉动阻尼器。4.梯度洗脱装置 梯度洗脱（gradient elution)是利用两种或两种以上的溶剂，按照一定的时间程序连续或阶段地改变溶剂的比例，从而改变流动相的极性、离子强度或pH值等，

12、改善分离效果的一种方法。梯度洗脱对分离组分复杂、容量因子k范围很宽的样品非常重要。高效液相色谱法中的梯度洗脱与气相色谱法中的程序升温非常类似，两者都是为了使样品的各种组分均在最佳容量因子值范围内流出色谱柱，从而达到改善峰形、缩短分析时间和提高分离效果的目的。在等温或等度洗脱（isocratic elution)情况下，或者由于保留时间过短而造成色谱峰拥挤、重叠，或者由于保留时间过长而造成色谱峰扁平、宽大，分离效果不好；而在程序升温或梯度洗脱情况下，各组分均能达到良好分离。梯度洗脱装置一般都采用微型计算机控制，可分为如下两类。（1)高压梯度洗脱装置：高压梯度又称内梯度。采用的是先加压后混合的方式

13、，即用几台高压泵将不同的溶剂，按程序规定的流量比输入混合室，再使之进入色谱柱。其特点是流量精度高、洗脱曲线重复性好、输液系统中不易产生气泡。（2)低压梯度洗脱装置：低压梯度又称外梯度或泵前混合。早期的低压梯度装置是常压下在容器中将溶剂按不同的比例混合，然后再由高压泵输入色谱柱。其优点是操作简单，比例准确，价格便宜；缺点是更换流动相比例不方便，溶剂消耗量大，自动化程度不高。目前许多仪器所用的低压梯度洗脱装置是四元梯度泵，该装置可进行二元、三元、四元梯度，电磁阀的开关频率由控制器控制，改变控制程序即可得到任意组成的流动相。该装置洗脱重现性好，精度高，仪器组合简单，一个泵即可进行梯度洗脱，但溶剂在混

14、合前必须高度脱气。一般采用四元梯度泵的仪器都配有自动脱气系统。（二）进样系统进样系统是将样品溶液导入色谱柱的装置。在高效液相色谱法中，对进样装置的要求是具有良好的密封性和重复性，死体积小。常用的进样方式有注射器进样和六通阀进样两种。前者与气相色谱法类似，进样时用微量注射器刺穿进样器的弹性隔膜将样品注入色谱柱。其优点是装置简单、价廉、死体积小。缺点是隔膜的穿刺部分在高压情况下容易漏液，而且进样量有限，重现性差，有时需停泵进样。目前普遍采用是六通阀进样在“装样”位置，用注射器将试样注入到六通阀的样品定量管中，此时流动相不通过样品管。然后转动六通阀手柄至“进样”位置，试样即随流动相进入色谱柱中。此法

15、的优点是进样时可保持系统的高压，进样方式简便、易操作，而且由于进样量可由定量管的体积严格控制，进样准确，重现性好，自动化程度高，适于作定量分析。目前，许多高效液相色谱仪配有自动进样装置。自动进样装置是由计算机自动控制进样阀，取样、进样、复位、清洗和样品盘的转动全部按预定的程序自动进行。自动进样重现性好，适合大量样品分析，节省人力，可实现自动化操作。目前比较典型的自动进样装置有圆盘式和链式两种。（三）分离系统分离系统包括色谱柱、柱温箱及连接管等。色谱柱是高效液相色谱仪的心脏部件，高性能的色谱柱是建立稳定、重现分析方法的根本。高性能的色谱柱与固定相本身的性能、柱结构、装填和使用技术等有关。色谱柱由

16、柱管和固定相组成。色谱柱分为分析型和制备型两类。分析型色谱柱长1025 cm，内径45 mm，制备型色谱柱长1030 cm，内径2040 mm。操作技术对柱效以及柱的寿命影响非常大，使用时必须注意：样品最好用针形滤器过滤，或尽可能通过萃取或吸附等手段除去杂质；流动相的pH值应控制在色谱柱所允许的范围内，一般为38之间；更换流动相时，应根据流动相的性质选择合适的溶剂冲洗仪器及色谱柱，防止流动相相互不溶，使盐析出，堵塞柱子；实验完毕，应选用适当的溶剂冲洗柱子，尤其是流动相含有盐时，应先用水冲洗，再用有机溶剂（甲醇或乙腈)冲洗。为了保持色谱柱的性能，通常在分析柱前要使用一个短的保护柱（又称预柱)。一

17、般保护柱内的填料与分析柱中的固定相一致，这样不仅可以将样品和流动相中的有害污染物保留，以延长柱子的寿命，而且在液-液色谱中，还可以使洗脱液在经过保护柱时就被固定相饱和，使分析柱内不产生固定液流失。高效液相色谱分析通常在室温下进行，但由于柱温对组分的保留值有一定影响，所以高档的仪器一般都配有柱温箱，以保证分析时温度恒定。（四）检测系统检测系统的关键部件是检测器。检测器的作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转变为可供检测的信号。高效液相色谱仪的检测器种类很多，按其应用范围可分为通用型和专用型（选择性)两大类。通用型检测器，又称总体性质检测器（bulk property detector)，其响应

18、值取决于流出物（包括试样和流动相)总的物理或物理化学性质的变化。属于这类检测器的有示差折光检测器、电导检测器。这类检测器测量的是任何液体都共有的物理量，所以应用范围广。但是由于它对流动相本身有响应，因此容易受温度变化、流量波动以及流动相组成等因素的影响，造成较大的噪声和漂移，灵敏度较低，不适于痕量分析，并且不能用于梯度洗脱。专用型检测器，又称溶质性质检测器（solute property detector)，其响应值取决于流动相中被分离组分的物理或物理化学性质。属于这类检测器的有紫外、荧光、化学发光、电化学检测器等。因为这类检测器仅对某些被测物质响应灵敏，而对流动相本身没有响应或响应很小，所以

19、灵敏度高，受外界影响小，并且可用于梯度洗脱。（1)紫外-可见检测器紫外可见检测器（ultraviolet-visibledetector，UVD或UV)是高效液相色谱仪应用最广泛的检测器，是一种选择性检测器，其特点是灵敏度高，噪声低，线性范围宽，基线稳定，重现性好，对流量和温度变化不敏感，适用于梯度洗脱，不破坏样品，能与其它检测器串联。紫外-可见检测器的工作原理和结构与一般的紫外-可见分光光度计一样，所不同是将样品池改为体积很小（512 µl)的流通池，以对色谱流出样品进行连续检测。紫外-可见检测器可分为固定波长型和可调波长型两类。固定波长型检测器因使用受到限制，已基本被淘汰；可调波

20、长型紫外-可见检测器是以钨灯和氘灯作为光源，检测波长从190800 nm连续可调，样品可以选择在最大吸收波长处进行检测。因此，该类检测器应用广泛。需要注意的是检测器的工作波长不能小于所使用流动相溶剂的截止波长。二极管阵列检测器（diode array detector，DAD)是最有发展前途的高效液相色谱检测器，属于多波长快速扫描紫外-可见检测器。它采用光电二极管阵列作为检测元件，构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接收器上的全部波长的光信号，然后对二极管阵列快速扫描采集数据，经计算机处理，获得定性定量色谱-光谱信息，主要特点为：在一次进样后，可同时采集不同波长下的色谱图，因

21、此可以计算不同波长的相对吸收比；可提供每一色谱峰的UV-Vis光谱，因而有利于选择最佳检测波长，用于最终建立高效液相色谱分析方法；检查色谱峰各个位置的光谱，可以评价色谱峰纯度。如果色谱峰为单一成分，色谱峰各点的光谱应重叠；在色谱运行期间可以逐点进行光谱扫描，得到以时间-波长-吸光度为坐标的色谱-光谱三维图（图10-4)，由于每个组分都有全波段的吸收光谱图，因此，可利用色谱保留值规律及吸收光谱综合进行定性分析。（2)荧光检测器荧光检测器（fluorescence detector，FD)的检测原理及仪器结构与荧光分光光度计相同，可对具有荧光特性的样品进行定量检测。荧光检测器的特点是：灵敏度更高，

22、比紫外-可见检测器高13个数量级，检测限可达10-1210-13 g/ml，是痕量分析的理想检测器；对温度和流动相流速的变化不敏感；可以进行梯度洗脱。荧光检测器不如紫外-可见检测器应用广泛，主要原因是能产生荧光的化合物不多。但是，生物领域中的许多物质，如氨基酸、胺类、维生素、甾类化合物、某些药物、代谢物等具有荧光，可用荧光检测。尽管有些化合物本身没有荧光，但可通过衍生化反应生成荧光衍生物进行测定。荧光检测器同可调波长紫外-可见检测器一样，也有多通道检测器，具有程序控制多波长检测、自动扫描功能。光导摄像管和光电二极管阵列检测器也应用于荧光检测器，通过计算机处理，可获得荧光强度-发射波长

23、-时间的三维色谱-荧光光谱图。新型的激光诱导荧光检测器（laser induced fluorescencedetector，LIF)已用于超痕量生物活性物质和环境有机污染物的检测，灵敏度可达10-910-12 mol/L。（3)示差折光检测器示差折光检测器（differential refractive indexdetector，DRID)是一种通用型检测器，它是利用纯流动相和含有被测组分的流动相之间折光率的差别进行检测的。几乎所有物质对光都有各自不同的折射率，因此，这种检测器可检测一定浓度的所有化合物。但是，由于DRID需严格控制温度，流动相中溶解的气体对信号有影响，灵敏度不高

24、，不能用于梯度洗脱等原因，限制了它的使用。（4)电化学检测器电化学检测器（electrochemical detector，ECD)种类较多，有电导、库仑、伏安、安培等检测器。最常用的是安培检测器和电导检测器。安培检测器是在一定外加电压下，利用被测物质在电极上发生氧化还原反应引起电流变化进行检测，它是一种选择性检测器。而电导检测器是基于物质在介质中电离后所产生的电导变化进行检测。ECD具有与荧光检测器同样的优点：高灵敏度和高选择性。缺点是：要求高纯度溶剂，流动相具有导电性，对流速、温度、离子强度、pH值等敏感，电极表面可能发生吸附、催化等，影响电极的性能和寿命。近年来，多通道EC阵列检测器已面

25、世，色谱流出峰的电位-电流数据可在很短的时间窗中产生。与DAD提供的化合物的光谱相似，EC阵列检测器可提供化合物的电化学曲线，用于化合物鉴别和纯度测定。（5)化学发光检测器化学发光检测器（chemiluminescence detector，CLD)是一种高选择性和高灵敏度的检测器。其原理是基于某些物质在常温下进行化学反应，生成处于激发态的反应中间体或反应产物，当它们从激发态回到基态时，能量以光的形式释放。由于物质激发所需的能量来自化学反应，所以叫做化学发光。当被测组分从色谱柱流出后，立即与化学发光试剂混合，发生化学反应，产生激发态中间体或产物，进而产生辐射，其辐射强度与被测组分的浓度成正比。

26、这种检测器不需要光源，也不需要复杂的光学系统，只要一个恒流泵将化学发光试剂以一定的流速泵入混合器中，使之与柱流出物迅速而均匀地混合发生化学发光，再通过光电转换装置将光信号变成电信号，即可进行检测。化学发光检测器和荧光检测器均是发光检测器，不同的是前者是由化学反应产生激发中间体或产物，不需要激发光源。化学发光检测器的灵敏度较荧光检测器的灵敏度更高，主要用于痕量分析。缺点是系统的复杂性及耐用性不佳，流动相和反应介质的要求常有矛盾，使色谱方法的建立复杂化。（6)蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detector，ELSD)是一种通用型检测器，对任何组分响应无歧视。其工作原理是经色谱柱分离的组分随流动相进入雾化室，被高速气流（氦、氮或空气)雾化，然后进入蒸发室，在蒸发室中流动相被蒸发除去，不挥发的待测组分在蒸发室内形成气溶胶，然后进入检测室。用一定强度的入射光（白炽灯、卤钨灯或激光光源)照射气溶胶而产