软枣猕猴桃多糖AAP-3b的生物安全性评价及抗肝癌活性研究

1、软枣猕猴桃多糖AAP-3b的生物安全性评价及抗肝癌活性研究软枣猕猴桃是在中国分布最广的猕猴桃属野生果树之一,我国东北三省的资源最丰富。其含有丰富的营养保健功能成分,果实、种子和根茎均可入药,是理想的保健食品。软枣猕猴桃果中含有多种生物活性物质,多糖是主要的生物活性物质之一。软枣狷猴桃多糖AAP-3b是从软枣狷猴桃果中提取纯化而得,经红外光谱扫描发现AAP-3b是果胶多糖，主要含p-糖昔键,其次还有一定量的a-糖昔键,PMP柱前衍生高效液相色谱法测定结果表明AAP-3b由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖6种单糖组成,其中甘露糖和半乳糖醛酸含量较高,摩尔百分含量分别为31.49

2、%、32.07%。高效凝胶渗透色谱测定结果表明AAP-3b中主要组分的重均分子量（Mw）为7298Da。本文以软枣狷猴桃多糖AAP-3b为研究对象，对其生物安全性、体内外抗肝癌活性进行研究,并对抗癌作用机制进行初探,以期为软枣猕猴桃的产业化、软枣猕猴桃多糖保健品的开发奠定基础。本课题通过大鼠急性毒性、细菌回复突变、体外哺乳动物染色体畸变、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核、基因突变、大鼠30d喂养一系列实验对AAP-3b的生物安全性进行了研究，通过DPPH!由基消除能力的测定、ABTS自由基消除能力的测定和铁离子还原能力的测定对AAP-3b的体外抗氧化能力进行了研究。通过形态学观察、活细胞计数、MTT集

3、落形成等方法，对AAP-3b体外抑制人肝癌细胞HepG2勺生长作用进行了研究。采用流式细胞仪检钢AAP-3b对细胞周期的影响以及诱导细胞凋亡作用，以瘤裸鼠的一般状况、血细胞数量及肝、肾功能的影响。探讨体外抗肝癌细胞的作用机制。用裸鼠建立了人肝癌模型，研究/SAP-3b对荷通过检测抑瘤率、不同组别肿瘤细胞的增殖活性以及免疫指数的测定,对AAP-3b体内抗肝癌活性及作用机制进行研究。主要结果与结论如下：1.急性毒性结果表明AAP-3b属于实际无毒物质。遗传毒性研究结果表明AAP-3b在代谢活化和非代谢活化两种处理条件下对沙门氏菌基因组均无致突变性；在代谢活化3h、非代谢活化3h和非代谢活化24h三

4、种处理条件下对体外培养的CHLi田胞均无诱发染色体结构畸变作用、对体外培养的小鼠淋巴瘤细胞L5178Y不具有致基因突变作用、在小鼠体内无诱发骨髓嗜多染红细胞微核率增高作用。大鼠30d喂养实验结果表明,AAP-3b在实验剂量范围内对大鼠的生长发育、血液学、血液生化学及病理学等方面各个指标均未发现有不良影响。2.体内抗癌活性研究：采用DPPHABTS及FRAP&对AAP-3b的体外抗氧化能力进行了研究，结果表明AAP-3b的DPPHSABTS自由基消除能力，铁离子还原能力在一定剂量范围均具有剂量相关性。体外抗肝癌活性研究结果为：AAP-3b在剂量范围50仙g/mL-500g/mL内，作用时间24h

5、-72h,使人肝癌细胞HepG2的形态发生改变,在一定范围内呈现时效关系和量效关系,显微镜下活细胞计数结果得出：AAP-3b对人肝癌细胞HepG2勺生长有较好的抑制作用，在剂量范围50Ng/mL-500ng/mL之间呈现量效关系。MTT：匕色法检测结果：AAP-3b对人肝癌细胞HepG旗有较好的增殖抑制作用，在一定剂量(50仙g/mL至500仙g/mL)和一定暴露时间(24h-72h)表现出明显的剂量和时间依赖性。集落形成实验结果：多糖剂量在50祖g/mL至200叱g/mL剂量范围内对集落形成的影响具有剂量依赖性。通过流式细胞仪检测AAP-3b对细胞周期的影响，并对其作用机制进行初步探讨。结果

6、表明软枣狷猴桃多糖AAP-3b可使人肝癌细胞HepG致生G2/M期阻滞,抑制癌细胞有丝分裂，在50仙g/mL至200g/mL剂量范围内作用24h呈现量效关系。软枣狷猴桃多糖AAP-3b对人肝癌细胞HepG澳有较好的诱导凋亡作用，细胞呈现出典型的凋亡生化改变，在50仙g/mL至200g/mL剂量范围内，作用48h至72h呈现量效关系和时效关系。3.体内抗肝癌活性研究：与模型对照组相比,AAP-3b低、高剂量组及阳性对照组的肿瘤增长比较缓慢；模型组裸鼠逐渐精神萎靡，行动迟缓，而AAP-3b剂量组及阳性对照组的状况好于模型对照组。给药结束后各剂量组、阳性对照裸鼠体重和模型对照组相比无统计学差异(P&

7、gt;0.05),但阳性对照组与高剂量组相比有显著差异(P<0.01),说明环磷酰胺可能对机体有毒副作用。AAP-3b对荷瘤裸鼠的一般状况、血细胞数量、肝、肾功能无明显影响,并且未见病理学改变。表明AAP-3b对机体无不良反应。体内抗月中瘤实验发现AAP-3b具有明显的抑制HepG2荷瘤裸鼠月中瘤生长的作用，剂量为50mg/kg-bwA200mg/kgbw时抑瘤率分别达16.76%、43.06%。表明AAP-3b在体内具有一定的抗癌活性。采用MTM检测不同组别月中瘤细胞的增殖活性，结果表明：AAP-3b可抑制人肝癌细胞HepG2勺增殖活性。剂量为50mg/kg-bw、200mg/kg-b

8、w时对HepG2干癌细胞的增殖抑制率分别为17.23%、41.51%。降低肝移植瘤细胞增殖活性可能是AAP-3b体内抗肝癌作用机制之一。免疫指数测定结果显示：与模型组比较，剂量为200mg/kgbw的AAP-3b可使脾脏指数显著提高(P<0.01),表明AAP-3b的抗月中瘤机制与免疫增强有关。与对照组相比,环磷酰胺阳性对照组的脾脏指数明显降低,表明环磷酰胺对免疫系统有抑制作用。AAP-3b体内抗肝癌活性的效果虽略弱于环磷酰胺，但其对免疫组织脾脏无损伤作用,对裸鼠的体重影响也弱于环磷酰胺,因此AAP-3b是相对安全无害的天然生物活性物质。以上实验结果表明：(1)软枣狷猴桃多糖AAP-3b具有生