shRNA原理及设计

1、shRNA原理及设计RNAi概述：RNA干扰(RNA interferenee, RNAi )是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA ( double-stranded RNA，dsRNA )诱发的、同源 mRNA高效特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链 RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默 (post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)。由于 RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特

2、异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。RNAi基本原理示意图:miRN Aprecursorsmall RNA duplexor stRNAmiRNAfu nctionperf&Ct pairingrTTTmTTMTiTrrTrriAAA. Ai n complete pairingtranslational repressionsiRNA有效片段的筛选。启动子表达人工设计的微小RNAmRNA的降解。AAAAAAAAA 1nucl

3、euscytosolIlliDrosha.Pasha Exportrn-5Dicergenepri-miRNApre-miRNApre-miRNAmiRNA.miRNAT duplexrm RNAmiRISCRNAi类别: 1、siRNA合成：原理：在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC )。激活的 RISC通过碱基配对定位到同源 mRNA转录本上，并在距离 siRNA3'端12个碱基的位置切割 mRNA。化学合成的siRNA具有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的

4、毒副作用小、可大规 模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行2、microRNA干扰载体构建：原理：载体采用 Pol II (miRNA),后者从长的转录本被加工，进而导致特异性的rnRNA degradation translational repressionRNA3、shRNA干扰载体构建：短发卡RNA (shRNA)是可以克隆到表达载体并表达短的干扰(siRNA, 19-21个核苷酸的 RNA双链)的DNA 分子。我们可根据靶标设计短发卡RNA(shRNA)序列并将其克隆到特定载体上。 19-29 nl > < ri 19-29 nt4、慢病毒 RNAi :原理

5、：慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但也有不同于逆转录病毒的组份和特性，作为基因治疗载体发展起来，最近已用于转基因动物制备。利用慢病毒构建的 shRNA/miRNA 载体，与化学合成的 siRNA和基于瞬时表达载体构 建的shRNA相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，lentivirus shRNA/miRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后， 可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的 细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞， 并且在感染后可以整合到受感染细 胞的基因组，进行长时间的稳定表达。5、腺病毒 RNAi :原理：腺病毒(adenovirus, AV

6、)是一种没有包膜的线状双链DNA，它能感染分裂细胞和非分裂细胞，在核内以神经元细胞的形式复制，存在多种AV血清型。到目前为止，构建的绝大多数载体都是基于血清型2和5,通过转基因的方法取代E1或E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在表达高水平E1和E3基因的细胞中复制，因此适合应用于治疗的高效控制系统。腺病毒载体能够高效传递和表达基因的能力(尤其是在体外)，由于具有宿主范围广，对人致病性低；在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因； 能有效进行增殖，滴度高；与人类基因同源；不整合到染色体中，无插入致突变性。对于难 转染的细胞，如原代或非分裂细胞，采用病毒递送 miRNA/shRNA的方式是非常

7、有效的选择。 几个概念的区分：shRNAs (RNA-Short hairpin RNAs):即短发夹RNA ,是设计为能够形成发夹结 构的非编码小RNA分子，可通过 RNA干扰来抑制基因的表达。ThomasRosenquist和Greg Hannon小组联合研究了在哺乳动物种系细胞中shRNAs的转移导致基因长时间稳定沉默的机制。microRNA ( miRNA，微小 RNA)是由内源性发夹(hairpin)结构转录产物衍 生而来的一种长为19 nt25 nt的单链RNA。在每种高等动物中，存在 200种以 上的miRNA，是最大的基因家族之一，约占基因组的 1%。siRNA： (short

8、/small interfering RNAs):即小干扰 RNA，是一种短片断双链 RNA 分子，能够以同源互补序列的 mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是 RNA 干扰途径（RNA interferenee pathway）miRNA，siRNA，dsRNA和shRNA都是RNA干扰技术中用到的小分子 RNA， 其不同之处在 miRNA 是单链 RNA，其余均为双链 RNA ； siRNA和dsRNA相 似；shRNA需通过载体导入细胞后，然后利用细胞内的酶切机制得到 siRNA而 最终发挥RNA干扰作用。miRNA 与 shRNA 图示:shRNA （短发夹 RNA ）的设计

9、：1克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（ loop）序 列分隔的，组成发夹结构，由 pol川启动子控制。随后在连上 5-6个T作为RNA聚合酶川 的转录终止子。2两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。3.Stratagene发现29个寡核苷酸较之原先推荐的 23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。 4在启动子下游的酶切位点下方紧连一个 C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转 录的发生。5.ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G。6.ShRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环都被