基于碳点荧光恢复法测定三磷酸腺苷物理学专业

1、基于碳点荧光恢复法测定三磷酸腺苷摘 要荧光半导体量子点因为具有比较特别的光学性能而得到了许多研究者的关注研究，它被很多科研者都用于研究生物领域的成像。但是，因为半导体量子点含有一些不良的重金属元素，对生物体会造成一定的毒性并且有潜在的可能会对环境造成一定的危害，它的这些弊端限制了它的进一步应用。而荧光碳点作为目前最受关注的纳米材料，它具有比较优越的各项性能，从而被大范围使用在生物方面的成像实验。但若在细胞内用传统的荧光量子点成像却特别容易使细胞出现故障，从而对细胞的生命活性造成一定不良作用。而细胞体内能量最关键的来源三磷酸腺苷，对维持生命体的机理有序进行有特别重要的作用。本研究拟采用微波合成法

2、对PEI(聚醚酰亚胺)与丙三醇微波加热反应制得荧光碳点(CDs)，从而建立检测细胞内ATP含量的发光方法，用制得的碳点与三磷酸腺苷反应，得到ATP的含量与系统中所测得的碳点数呈成线性关系。关键词：碳点；适配体；三磷酸腺苷AbstractFluorescent semiconductor quantum dots have been studied by many researchers because of their relatively specific optical properties. They have been used by many researchers in the f

3、ields of biomimetic imaging and biological imaging. However, because the semiconductor quantum dots contain some bad heavy metal elements, the organisms will cause some toxicity and potential may cause some harm to the environment, its shortcomings limit its further application. The fluorescent carb

4、on spot as is the most concerned about the current nano-materials, because it has a superior performance, a wide range of use in biological imaging, if the cells in the traditional fluorescent quantum dot imaging is particularly easy to make cell failure, Thus causing a certain adverse effect on the

5、 cell's life activity. The most important source of energy in cells is the most important source of adenosine triphosphate, which plays a particularly important role in maintaining the order of the organism. In this study, we used microwave synthesis to synthesize fluorescent light (CDs) by PEI

6、(polyetherimide) and glycerol microwave heating to establish the method of detecting ATP content in intracellular ATP. Adenosine triphosphate reaction, the ATP content and the system measured in the carbon number was linear relationship.Key words:Carbon point;Aptamer; Adenosine triphosphateAbstract目

7、 录摘 要I前 言11 文献综述21.1 概述21.2 碳点的应用21.2.1 在生物成像的应用21.2.2 作发光材料的应用31.2.3 作光催化剂的应用41.2.4 作药物载体的应用51.2.5 作检测探针的应用61.3 本课题的研究意义与研究内容72 实验部分93 结果与讨论结 论参考文献致 谢目录前 言碳点作为目前最受关注的新新纳米荧光材料，因为其具有比较好的各项性能而受到了科研者们的特别关注。用于制作碳点的碳源可供使用的材料比较多，如果想制得碳点会有许多种不同的制作方法。至今为止，碳点已慢慢成为碳材料群体里冉冉升起的新星。就现有的研究成果发现，大家都主要在研究如何去制备碳点，还有碳点

8、在不同的领域它是如何利用和使用的。如果用微波法制备碳点合成速度往往更快一些，而且加热也更均匀一些。以本研究拟采用微波合成法对PEI(聚醚酰亚胺)与丙三醇微波加热反应制得荧光碳点(CDs)。然后用投射电子显微镜、X射线光电子能谱分析等技术对合成的硫掺杂碳点进行光谱性质、粒径大小这些参数进行表征。在最合适的条件下所制得的硫掺杂碳点不仅有产物产率比较高的特点，还有较为均匀的粒径分布，光也比较稳定，可以长时间保存等这些优点。1 文献综述1.1 概述三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，简称为ATP)是活细胞内的一种高能磷酸化合物。ATP在全部的生命体中都存在，特别方便保存和使用，是

9、细胞死亡和新生所需要的重要能量。在一般的反应中，基本都是通过释放磷酸分子而起到放出能量的目的，对保持生物体的正常性能维持有着不可替代的用处。测定细胞内三磷酸腺苷含量对细胞机体的代谢和活性都具有比较大的意义。碳点是一种逐渐壮大发展的荧光纳米材料1-3，最开始是Xu课题组4处理用电弧因放电而产生的烟灰并用它来制得单层碳纳米管时，无意间发现了一种发荧光的物质，刚一被发现，它便吸引了许多研究者的目光去钻研其各项特性。而且它自身存在很多的优势， 比如能耐光可漂白、光比较平稳、光强高、激发波长和发射波长能改变这些好处；与此同时, 跟已经大批量投入使用的纳米荧光颗粒相比, 又具有生物相容性好、低分子量、毒性

10、低和小粒径等这些特点, 在生物成像5-8等许多范畴都具有很好的利用远景。可是，荧光碳点在分析检测中的运用却很少有报导。1.2 碳点的应用1.2.1 在生物成像的应用就一般我们比较常见的量子点来说，不管是在生物体内部还是在生物体外部都可以进行光学方面的成像试验，但不管是对于人的身体健康来说还是对环境来说，因为它具有一定的危害性，在极大程度上将导致它的用途会受到一定的限制和影响9。只有具有低微毒性和具有生物相容性的碳点才有极大的可能去代替量子点，从而在生物成像上发挥出足够重要的作用。碳点的表面比较容易被修饰，可以使用它表面的羧基，羟基和氨基这些官能团，然后在它的表面连接到核酸适配体，因为它对生物分

11、子具有比较特殊的识别标记作用，可用于对待测分子进行精准的选择和较高灵敏度的检测。最早的时候Sun10课题小组对碳点生物成像方面进行了一定的研究分析。他们在含有碳点的培育基中接种了MCF-7细胞，然后培养了大约2小时后，在荧光显微镜中看到了通亮的荧光从细胞周围发出，在此实验中可以直观的观察到生物体的细胞膜和细胞质大部分都充满了荧光。Ray课题小组11将碳点放进含有艾氏腹水癌细胞（EACS）的溶液当中，此溶液的浓度约为107 cell/mL，通过研究此实验的现象，他们发现了碳点可以不需要经过被酸氧化和表面发生钝化，就能够迅速并且直接的渗透到细胞内部。而刘等人制出了粒子径长大致约为1.52纳米的粒子

12、碳点，这种碳点可被小鼠P19祖细胞和大肠杆菌细胞所吸收摄取，它的荧光激起波长大约是在458514纳米这个区域之间，具有很强的光稳定性。如果碳点能够和多肽或者转运蛋白结合在一起，将会更方便碳点从细胞膜穿过，从而增强它对细胞内物质的标记识别功能。Li课题组12制备碳点先使用的是支架法，然后再对含有氨基端基的化合物进行钝化其表面的步骤，让它能够和转铁蛋白相互结合，得到与之共轭的转铁蛋白碳点（Tf-CDs）。之后把已共轭和没有共轭的碳点与HeLa 细胞一同培育，发现已共轭细胞的荧光亮度明显大幅度增强。在生物成像领域，使用纯天然原料制备而成的碳点也得到了成功的应用，例如Sahu课题组13使用水热处理法一

13、步制备的碳点具有强烈的绿色荧光，不仅如此它还能够有效进入人骨肉瘤细胞（MG-63），然后被波长为488纳米的光激起发出清晰的绿色荧光。以上这些研究都说明了碳点的荧光性能将为它在生物成像领域的应用研究开辟一个更宽广的前景。1.2.2 作发光材料的应用Guo 课题组14通过在高温下热分化处理含有大量环氧基的聚苯乙烯之后，制备出了不同颜色的荧光碳点（如图1所示）。Wang等人实验所用溶液的溶剂是十八碳烯，表面钝化剂使用的是1- 十六烷胺，然后以柠檬酸作碳源来制碳点。当通过的电流达到5 Ma/cm2 这种密集程度时，用此碳点合成物件的外部最大效力为百分之零点零八三，可被观测到的显色程度为八十二。图1

14、通过发光晶体的碳点因为受热而产生分解的图像在大气中Qu课题组15把含有碳点的水溶液涂抹在纸上并进行干燥处理，碳点的荧光与碳点覆盖的纸张两者发出的荧光相似，可用于信息加密和防伪。而且还可以与市面上售卖的能发出荧光的绿色油墨实行两重加密（图 2a）。在被蓝色光激起下，表面出现荧光数字“888”，颜色为绿色；在被绿色光激起下，市面上所卖的那种可发出荧光的绿色墨水却没有发光，只能看到碳点发出了赤色荧光，数字为“395”。在确定了这类碳点没有毒的前提之下，在蓝光激发下然后再涂抹在人的皮肤上可观察到发出绿色荧光，而且能够很容易地用水冲洗掉（图2b、c）。碳点作为发光材料使用也表现出了其比较优越的性能。图

15、2 （）当在不一样的波长下在水里溶了碳点的溶液和售卖的发光绿色油墨各自发出荧光的区别图；（）人身体上用发荧光碳点的书写表现图；（）有亮光的指纹用碳点构成的除此之外，如果把碳点应用到可以发光的材料上，比如可以用到发光二极管的器件、宏观的结构材料和可以发荧光的油墨等这些物件上面，它们都将会有非常有潜力的发展。1.2.3 作光催化剂的应用光的氧化还原反应和催化反应技术在能源领域、绿色化学处理及环境研究领域都占有非常大的比例，而且在这些领域都表现了其不错的优越性并有着很好的发展方向。在新能源、绿色化学等领域，光的催化氧化还原反应是一种非常有前景的化学工艺。跟别的纳米质料相比来说，在这一范畴碳点因为具有

16、良好的的物理化学性质（如光诱导电子转移、氧化还原性）表现出了很好的利用远景。Li课题组16的实验所用到的碳源是葡萄糖，此实验通过超声作用获得碳点，在溶液呈碱性的条件下放入硫酸铜和聚乙烯吡咯烷酮，然后获得了一种共同物CDsCu2O，他们还通过电解石墨棒的电化学合成方式获得了粒径为14 纳米的碳点。在近红外光下使苯甲醇通过H2O2的氧化催化作用得到苯甲醛，转化率高达百分之九十二，选择性甚至达到了百分之百（图 3）。图3碳点100%选择性的示意图除了这些以外，碳点复合材料还可以通过光催化作用来有效降低分解废弃污染物的不良性能。就比较常见常用的光催化材料（比如TiO2）和一般的半导体量子点而言，它们都

17、是因为带隙过于宽的原因，只能局限性的吸收到近紫外光线和紫外光线。但是碳点却能够进行上转换，它可以吸收到可见光线。2010年，Kang课题组17使用Sol-Gel法制备了碳点和二氧化钛的复合材料与碳点和二氧化硅的复合材料，而且他们还证明了自己的猜想，确认了这两种含有碳点的复合材料在能见光的照射下可以分解亚甲基蓝。由以上实验发现碳点是具有很大发展前景的一种对光有感知识别作用的催化材料。1.2.4 作药物载体的应用因为我们常见的这些药物它们没有能被查看的性能，也不能够被定位去观察它的性能，如果可以用发荧光的纳米碳点作为药物的载体，那便有可能解决这些问题。赖课题组18在很热的温度下把甘油高温热解得到碳

18、点，然后再把介孔纳米这种粒子包起来，最后再用PEG来润色。将一种用来抵御癌症的叫做阿霉素（DOX）的药物用PEG来润色一下，再去研究DOX这种药物在HeLa细胞中的接收速率。纳米复合材料在阿霉素中通过PEG修饰经由内吞作用进入到细胞内，不同于阿霉素的被动运输，此过程中细胞的摄入速度得到了一定提高。CDs和阿霉素在细胞核和细胞质内分别发赤色和蓝色荧光（图4），根据这种同色荧光却比例不同的情况，在原位置可以迅速看到阿霉素在细胞内的释放效果如何，从而CDs实现了作为药物载体的可观测性与可追溯性。该实验合成碳点的方法不仅操作简单，而且易于工业化批量生产。因为生物体对能见光区具有很强的吸收性能，而且碳点

19、在药物的传递领域和靶向定位治疗领域都有着比较宽泛的使用前景，所以将荧光碳点用在含有药物的载体上面会有很大的可能性处理并且解决这些比较困难的问题，比如一般常见的药物载体不能被追踪和观察到等情况。图4 在Hela细胞培养基中负载阿霉素的经PEG修饰的碳点差别时刻的荧光图象（ac）；Hela细胞248小时后细胞核和细胞质的荧光光谱（d）1.2.5 作检测探针的应用碳点作为一种新的带金属离子的荧光探针，容易被电子受体在溶液中轻易猝灭，它可以被用来测验存在于溶液里面的的这些金属离子，并能在一定范围内测定它的浓度，之后可以进行痕量分析19测定。要想制备碳点，就制备碳点的碳源来说，它不仅有很多制备来源而且很

20、便宜，大多采用天然气烟灰、蜡烛烧的灰、西瓜的皮等这些草本植物。刘课题组20用水热法对禾本科植物进行处理，完成了水溶性氮掺杂碳量子点的制备实验，并且对水样中的Cu2+也成功地进行了检测，溶液上限为1 nmolL。萨利纳斯卡斯蒂略组21在180摄氏度聚乙烯亚胺分子的存在下，通过热分解柠檬酸，获得了均匀粒径为12纳米的碳点，该碳点不仅具有上转换和下转换荧光性质，还有好的水溶性，可应用于检测细胞内的铜离子。此实验对Cu2+的选择性数据表明，排除掉三价铁离子，其它离子对于检测结果没有太大的影响（图5）。图5（a）碳点对铜离子的选择性；（b）碳点对铜离子检测的影响（不同离子下）。350纳米紫外光下激起灰色

21、，850纳米近红外光激起黑色通过微波处理甘油和PEG1500，Lin等人22获得了均匀粒径为35 纳米的碳点，在紫外光（ex 365nm，荧光量子产率12）下发出了特别耀眼的绿色荧光。表面经过丝氨酸修饰润色的碳点，可用于测定亚硝酸盐。实验结果表明，在1.0x10-71.0x10-5摩尔每升之间荧光强度与NO2-的浓度呈线性关系。该碳点也已经成功的用于检测河水，纯奶，还有水池水中的亚硝酸盐含量。Zhao等人制备的碳点23在可见的紫外线区域不能被吸收，这种具有羧基功能化的碳点是通过氨基十一烷酸和柠檬酸缩合制备而得到的，更贴近于量子点的性能。因为Eu3+ 对PO43-具有一定的选择性，可以用它来调控

22、碳点从而获得“off-on”式荧光探针，并用于人工湿地上检测磷酸盐含量。Xu课题组24制备了以葡萄糖为碳源并且可溶于水的碳点，然后将TBA29和TBA15两个氨基色凝血酶适体转移到二氧化硅纳米颗粒和碳点中，便可形成“碳点-凝血酶-SiO2纳米颗粒”这样的夹层构局。此方法的检出限为1 nmolL，而且灵敏度跟之前的报道相比也有了明显的提高。此外，碳点也被广泛的用于其他金属离子的检测中。1.3 本课题的研究意义与研究内容碳点作为一种新新的纳米材料，具备不同于其他材料的发光机能、生物互容性、优越的化学稳定性和概况功效可调理性等特色。它所具有的光可调性、耐光性、高荧光强度等特征，已成功应用于生物检测探

23、针的合成和研究。然而却因为碳点的荧光量子产出率比较低，成为了其使用受到一定限制的问题所在。碳点的发光机理及其结构的研究仍处于初步的摸索阶段，因此应加大发光机理方面的研究力度，从而为有效提高荧光量子产率提供理论指导。在各位前辈的研究基础上，本课题拟用聚乙烯亚胺和丙三醇作为前驱体，通过微波法合成量子产率高的荧光碳点，基于三磷酸腺苷适配体与碳点之间的静电作用，使碳点荧光猝灭，当有三磷酸腺苷存在时，由于适配体与三磷酸腺苷之间的特异性结合而使碳点荧光恢复，从而实现基于碳点荧光恢复的三磷酸腺苷检测。参考文献颜范勇,邹宁,王猛,等.荧光碳点制备及应用J.化学进展,2014,26(1):6174韩文英.荧光碳

24、纳米粒子的表征、制备及其在细胞标记中的应用D.山西:山西大学，2012周瑞琪,吕华,陈佳慧,等.碳量子点合成、表征及应用J.药学进展,2013,37(1):2430Xu XY,Ray R,Gu YL, Ploehn HJ, Gearheart L,Raker K,Scrivens WA.Electrophoretic analysis and purification of fluorescentsingle-walled carbon nanotube fragments. J Am Chem Soc,2004,126:1273612737Cao L,Wang X,Meziani MJ,Lu

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