蜂蜜中四环素类抗生素残留的微生物杯碟法测定

1、蜂蜜中四环素类抗生素残留的微生物杯碟法测定 一、试验目的 把握微生物杯碟法测定蜂蜜中四环素类抗生素残留量的原理和办法。 二、试验原理 样品中四环素类抗生素经mcllvaine缓冲液提取、sep-pak cl8住纯化后，素等残留以薄层色谱和生物检测法相结合举行分别和定性，以蜡样芽孢杆菌为试验菌株，采纳微生物杯碟法举行定量。 三、仪器与试材 1仪器与器材 生化培养箱、灭菌锅、恒温水浴锅、旋转蒸发器、离心机、绽开槽(内长20cm、宽15cm、 高30cm)、长方形培养皿(高×宽×长，15cm×8cm×23cm)、色谱用纸(7cm×22cm)、微量 注

2、射器、游标卡尺、不锈钢牛津杯(内径6ram、外径8mm、高度10ram)。 2菌种与培养基 (1)菌种：蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus varmycoides)，菌号63301。 (2)菌种培养基：胰蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、nacl 2.5g、琼脂15 .0g、蒸馏水1000ml。将以上成分加热溶解后，调ph为7274，分装于茄子瓶与试管中，于121灭菌15min。用于菌种培养和活化。 (3)检测培养基：胰蛋白胨5.0g,牛肉膏3.0g、k2hpo4 3.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000ml。将以上成分加热溶解后，调ph为6.5±0.1，分装于锥形瓶(每瓶

3、200ml)，于121灭菌15min。 3试剂与溶液 (1)常规溶液：hcl溶液(0.01moll)、mcllvaine缓冲液ph=4，将27.6g na2hpo4·12h2o、12.9g柠檬酸(c6h8o7·h2o)、37.2g edta二钠加水溶解后定容至1000ml、磷酸缓冲液(0.lmoll，ph=4.5，灭菌后，于4保存)、edta二钠水溶液(50gl)、绽开剂正丁醇一乙酸一水(4+1+5，体积比)。 (2)waters seppak c18柱(或国产pt-c18柱)：用法时，先用10ml ch3oh滤过活化，再用10ml蒸馏水置换，然后用10ml edta二钠溶

4、液洗柱。 (3)抗生素标准溶液(1000gml)：称取四环素、土霉素、金霉素标准品适量(按效价进 行换算)，以hcl溶液溶解并定容。4保存，7d内稳定。 4试验材料 23种蜂蜜，各100g。 四、试验步骤 1样品提取 (1)定量分析用样品提取液的制备：称取混匀的蜂蜜10.0g，加入30ml mcllvaine缓冲液，搅拌匀称溶解后，过滤，滤液以sep-pak c18。柱滤过后，以50ml水洗柱，再以10ml甲醇洗脱，洗脱液经40减压浓缩蒸干后，以磷酸盐缓冲液溶解并定容至5ml。 (2)定性分析用样品提取液的制备：称取蜂蜜5.0g，按步骤(1)处理，甲醇洗脱液经40减压浓缩蒸干后，用0.1ml甲

5、醇溶解。 2芽孢悬液和平板的预备 (1)将菌种移种于茄子瓶培养基斜面，于37培养57d，当芽孢率达85，以10ml无菌水洗下菌苔，离心、洗涤2次后，以10ml灭菌水恳浮芽孢，于65恒温水浴中保温30mi。芽孢液于室温下放置24h后，再于65恒温水浴中保温30min，冷却，4保存。 (2)将芽孢液系列稀释后，定量加入检测培养基中混匀，以025gml的四环素标准液检测芽孢的用量。当该浓度四环素标准液产生15mm以上清楚、完整的抑菌圈时，芽孢悬液的浓度为适合浓度。 (3)将适当稀释后的芽孢液加到5560c的检测培养基中，混匀后，倒平板，凝固后，在 每个平板(9cm)半径23cm的圆周上匀称放置6个牛

6、津杯，牛津杯与牛津杯之间成60°角。 3定性测定 (1)将色谱用纸匀称喷上磷酸缓冲液，于空气中晾干，备用。 (2)在距色谱用纸底边25cm起始线上，分离滴加10l 2gml四环素、土霉素及lgml金霉素标准稀释液与定性样品液(各样点内距应大于1em)，将色谱用纸悬挂于盛有绽开剂的绽开槽中，以上行法绽开，待溶剂前沿展至10cm左右处时，将色谱用纸取出，于空气中晾干。 (3)将晾干的色谱用纸紧贴于事先加有60ml含有试验用菌的检测培养基的长方形培养皿 中，30min后移去色谱用纸，在37±1培养16h。 (4)对照样品提取液与标准品溶液抑菌圈的位置，分析样品中所含四环素类抗生素

7、的类。 4定量测定 (1)取标准原液按1：08比例，以磷酸缓冲液稀释，使四环素、土霉素系列标准液的浓度为0.16gml、0.21gml、0.26gml、0.32gml0.40gml、0.50gml，参考浓度为0.25gml；金霉素系列标准液的浓度为0033gml、0.041gml、0.051gml、0064gml、0.080gml、0.100,ugml，参考浓度为0.050gml。 (2)以3个检定用平板为一组，每一种抗生素6个标准液浓度需要6组18个平板，3种抗生素共需要54个平板。在每组各个检定用平板的3个间隔牛津杯内注满一种抗生素的标准品参考浓度液，在另3个牛津杯内注满该抗生素的一个标准

8、浓度液，于37±1培养16h，然后测量参考浓度和标准液浓度的抑菌圈直径，求得各自9个数值的平均值，并计算出各组内标准液浓度与参考浓度抑菌圈直径平均值的差值f，以f值为横坐标，以标准液浓度对数为纵坐标，在半对 数坐标纸上绘制标准曲线。 (3)同样，取3个检定用平板，在每个平板上 3个问隔的牛津杯内注满0.25gml四环素 参考浓度液(或025gml土霉素或0.050gml金霉素，可以按照上述定性结果，确定抗生 素种类)，另3个牛津杯内注满被检样品液，于37±1培养16h，测量参考浓度和被检样液的 抑菌圈直径，求得各自9个数值的平均值，并计算出各组内标准液浓度与参考浓度抑菌圈直

9、径平均值的差值ft。 (4)按照被检试样液与参考浓度抑菌圈直径平均值的差值ft，从该种抗生素标准曲线上查 出抗生素的浓度ct(gml)。样品中若同时存在两种以上四环素类抗生素时，除了四环素、金 霉素共存以金霉素表示结果外，其余状况均以土霉素表示结果。试样中四环素类抗生素残留量按下式计算： xi=ctv/m 式中，xi为试样中四环素类抗生素的残留量，mgkg；ct为样品提取液中四环素类抗生素的浓度，gml；v为待检测样品提取液的体积，ml；m为样品的质量，g。 五、注重事项 1囫囵试验过程必需严格举行无菌操作，须要时抗生素标准溶液也可以举行膜(0.22m)过滤除菌。 2蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus varmycoides) 63301，可从中国药品生物制品检定所 购买。 3在定性测定中，从绽开槽中取出的色谱用纸一定要使绽开剂挥发整洁(可以用电吹风机 的冷风加速绽开剂的挥发)，否则将可能影响随后举行的抑菌试验结果。 4为了防止溶液从牛津杯中溢出，加完溶液放置23h后，再平稳地移入培养箱中。也可以在牛津杯中加入定量的比牛津杯容积稍小体积的溶液，这样就可以避开牛津杯中溶液的溢出。 5因为芽孢浓度可以影响抑菌圈的大小，所以应对芽孢悬液的用量举行分析，普通每100ml测定培养基中加入0.510ml芽孢浓度为106ml的芽孢悬液比较合适。 6在重复性条件