骨质疏松症动物模型的研究进展

1、陕西理工学院科研实践论文 科研实践论文 骨质疏松症动物模型构建的研究进展 系 （院）：生物科学与工程学院 专业年级：食品质量与安全专业1102班学生姓名：王晓乐 学 号：1112034033 指导老师：郑红星 完成时间：2013年5月21日 骨质疏松症动物模型构建的研究进展作者：王晓乐 所在单位：（陕理工生物科学与工程学院食品质量与安全专业1102班，陕西 汉中 723000） 指导老师：郑红星摘要 近年常用于骨质疏松的模型动物有大鼠、小鼠、兔、犬、羊、猪等。以大鼠最为常用。用于制模的方法有年龄相关的骨丢失，去势模型,药物类模型，废用性骨质疏松模型，营养类模型等。其中以去势模型，特别是去卵巢动

2、物模型最常用。骨质疏松动物模型的建立有手术切除卵巢、药物诱导、饮食限制和制动术等几种方法。也有将卵巢切除与其他方法结合应用以加快失骨的报道。关键字 骨质疏松；动物模型；研究进展引言 骨质疏松症是可能由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病。用于骨质疏松症模型动物模型首先应该考虑的是模型应与人类骨质疏松的临床症状及组织行为相似，但某些动物模型在各个方面完全与人类骨质疏松症的临床表现一致是很困难的，因此动物模型侧重与表现其某一阶段、某些症状或一些病理生理变化，作为观察特定阶段和指征的病理模型。美国骨质疏松药物研究指南（美国FDA）认为目前没有

3、一种动物模型能模拟人类骨质疏松的所有特征。已有报道用小鼠，大鼠、兔、羊、猴等复制骨质疏松模型。1实验动物1.1 大鼠 啮齿类动物如大鼠是迄今为止在OP研究中使用最广泛的实验动物，并且美国食品与药品管理局（FDA）也要求治疗OP的药物实验研究采用去卵巢大鼠和另一种非啮齿类动物模型（如狗、猪、羊、灵长目）进行实验。大鼠用于OP研究的优点是：（1）分布广，繁殖快，花费低，体积小，易于饲养和管理。（2）有明显的生长期和成年期，容易观察年龄对骨组织的影响。（3）骨骼系统解剖与人类有众多相似之处。（4）成年大鼠多个部位的松质骨骨量可在一段较长时期内保持稳定，这是研究松质骨重建的合适条件。（5）与人类相似的

4、松质骨分布和重建功能及板层骨的骨小梁重构能力。（6）大鼠去卵巢后，血清雌二醇明显下降，骨代谢活跃，骨转换增强，骨吸收大于骨形成，起初有一个快速的以松质骨丢失为主的阶段，松质骨骨量减少，骨强度下降，较好地模拟了正常人绝经后高转换型OP。（7）去卵巢大鼠对雌激素，他莫苷芬、二磷酸盐、甲状旁腺素和降钙素等药物的反应亦与人类有相似之处。故去卵巢大鼠模型已被公认为研究绝经早期骨丢失的一种良好的模型。但其缺乏也不容忽视：大鼠终身维持活跃的骨构塑：骨骺闭合迟：皮质骨内骨重建罕见，缺乏Haversian系统：大鼠去卵巢后不发生脆性骨折。此外，大鼠体积小，不允许反复进行骨组织活检及大量采血液标本。1.2 小鼠

5、采用小鼠进行骨代谢遗传因素的研究，了解特殊骨骼类型与遗传基因的联系；或是导入目的基因或敲出目的基因，观察其表型特征和病理变化，是目前OP研究领域中最感兴趣的课题之一。鉴于SAM/P6、57B1/6J、和C3H/HeJ等小鼠的峰值骨量（PBM）的差异，应用分子生物学技术，对特定基因位点进行完整的基因学研究，识别一个活多个OIP相关基因，为大动物和人类的研究提供有益的经验。最近日本研究人员选用一种基因突变小鼠既twy小鼠进行OP研究，发现这种小鼠体内存在不平行钙化现象，颈椎有有高度骨化现象，而腰椎发生高转化率的OP1.2。1.3 狗 皮质骨与松质骨的比例、Haversian单位和松质骨重建均与人类

6、相似；存在年龄相关性OP和废用性OP；去睾丸狗有类似人类骨吸收大于骨形成的改变。但狗为肉食动物，食物中不恰当的钙磷化例以及小肠对钙的吸收低，易产生继发性甲状膀腺功能亢进症。另外，骨量丢失咱切除卵巢和子宫的狗只是一个暂时现象。1.4 小型猪 体积小，占空间小，易于实验操作管理；有板层骨结构，皮质骨重建和松质骨对视与沉积的发生率与人类相似；尽管通过切除卵巢、子宫和用氟化物诱导的OP与人类OP存在骨量和骨强度的差别，但在表现形式上与人类相似；另外，它还可存在骨量减少相关的自发性骨折。不足之处是费用高，分布稀少，饮食要求严格，尤其害死钙的摄取，容易影响到骨密度（BMD）因为子宫的血管容易破裂；卵巢、子

7、宫切除手术较为困难；通人类相比有较高的骨量及更致密的小梁骨网状结构。1.5 绵羊 从多方面因素看，绵羊是一种极具潜力的OP模型动物：性情温顺，易于饲养、管理；有自发性的排卵和与女性相似的激素分泌规律；氟化物在骨的沉寂和骨细胞的毒性反应方面与人类相似；今年的研究发现，低龄绵羊（小于34岁）的皮质骨是丛状骨，二高龄绵羊（79）可见到Haversian系统的重建3。但作为OP模型也有其不足之处：绵羊为草食动物，维生素代谢和矿物质需要量以及磷代谢与人类相差较大，绵羊尿中磷排泄较人低，消化道是绵羊磷排泄的主要渠道；因绵羊为反刍类，如果进行口服药物吸收实验，需建立胃痿管；没有自然绝经；通常动情期只出现在秋

8、冬两季，且BMD、生化指标、骨组织形态学指标有季节性和日节律性波动；缺乏自发性骨折。1.6 兔 繁殖率高，容易饲养，抗空气感染力强；骨转化快，当性腺发育接近6个月左右时，其骨骼既发育成熟，成年兔有Haversian重建活性，可用作合成代谢促进药物对松质骨及Haversian系统重建作用的研究4，以及用于研究睾酮及雌激素对生长发育过程中BMD的影响，或作为糖皮质激素诱导OP动物模型。但因兔的松质骨含量少，给骨计量学检测带来一定困难。1.7 灵长目 与其他动物相比，灵长类动物用作OP动物模型具有突出优势；身体保持直立位，有与人极为相似的骨生物力学特性；具有Haversian和松质骨重建活性；存在增

9、龄性和制动性骨丢失；有与人类女性相似的动情周期和绝经，卵巢功能停止后骨的反应亦与人类相似；由于灵长类动物与人类在进化树种的位置最近，对建立基因显性特征研究方面同样很有帮助。但由于费用昂贵，饲养管理条件要求高，操作危险，试验周期长；不可避免地携带传播动物源性传染病；作为绝经后OP模型，雌性灵长类的年龄必须足够大等极大地限制了它们的应用。2选择骨质疏松动物模型应注意的因素2.1骨生长期和成年期 理想的骨质疏松动物模型应有明确的生长期和成长期。在骨质疏松研究中生长期的骨积累和成年期的骨峰值是重要的概念。在骨生长期，以骨塑建（bone modeling）为主，骨发育的代表是长轴骨的生长，骨塑形能力强，

10、骨代谢活性高。，除了遗传因素，生长期的营养、运动、机械负荷和日照时间等决定峰值骨量。成年期的骨发育是以骨重建为主。，松质骨的骨重建活性高于皮质骨。骨代谢处于相对稳定的状态。测定峰值骨量和成年后的骨量丢失是骨质疏松研究中的重要的手段。进行实验时，明确实验动物处于生长期，还是成年期。如实验目的是研究成年人疾病的过程，应用成年期的动物。若观察危险因素对骨骼系统生长的影响，应选用生长期的动物。2.2骨塑建与骨重建骨塑建（bone modeling）是骨生长期骨的形状和结构的生长变化，还在成年期期调整骨的构筑和骨量分布而适应外力环境的改变。骨重建（bone remodeling）是指骨组织中的基本单位新

11、骨取代旧骨的骨吸收与骨重建过程，并无骨形状的改变。骨质疏松动物模型应可观察到松质骨和皮质骨明确的组织形态学变化。2.3雌激素与绝经大多数妇女经历27年的自然绝经期，手术女性因手术而绝经。体内雌激素水平下降导致多得快速失骨可持续58年，逐渐进入一个缓慢失骨期。这些变化主要发生在松质骨和皮质骨内表面5。雌激素替代疗法可减少骨量的丢失，骨折发生率降低。骨质疏松模型选择的动物如有周期性的月经或动情期，有自然绝经现象和对雌激素替代疗法有良好的反应，可能是用于骨质疏松研究的最佳模型。比如，大鼠去势模型是研究绝经后骨质疏松的经典动物模型。2.4其它动物骨骼的形态、骨密度和骨生理与人类不尽相同，而且骨质疏松症

12、的变化往往经历数年或数十年，但动物模型在数周或数月复制出相像的变化，二者是否有差距，有待进一步研究，因此在实验结果判定和外推时需慎重。3复制骨质疏松症的方法骨质疏松动物模型的建立有手术切除卵巢、药物诱导、饮食限制和制动术等几种方法。也有将卵巢切除与其他方法结合应用以加快失骨的报道。3.1切除卵巢去势法以大鼠为例，大鼠有明显的生长期和成年期，雌性大鼠发情期规律，每四天出现一次持续18小时的雌二醇峰值时间。当卵巢切除以后，如上所述，出现骨转化率增加，松质骨出现显著的骨丢失，骨小梁变细，单位体积骨小梁骨量降低，骨强度下降；经历约4月的快速骨丢失期，随后为一段较长的缓慢的丢失阶段5。肥胖对骨丢失有一定

13、保护的作用；肠道的钙吸收减少；这种特征较好地复制了女性正常绝经时骨量丢失的情况。予雌激素替代治疗时无骨转化增加和失骨。抑制人骨转化的药物如双磷酸盐类和降钙素也可有阻止大鼠的高转化率和骨丢失。这与绝经后妇女对相同治疗的应用效果一致。该模型已被反复证实，切除大鼠卵巢，血中雌激素水平显著降低，并出现骨质疏松病理变化，该法已成为制造绝经后骨质疏松症动物模型的有效方法6。雌激素减少后的骨量的减少和骨形成关系如何尚未阐明。骨骼成熟后，在一生中仍不断进行更新与改造，这就是骨重建。骨重建过程是旧骨的吸收，新骨的形成的复杂过程。主要有两种细胞在发生作用：一种是通过分解代谢促使骨质吸收的破骨细胞，一种是通过合成代

14、谢促进骨形成的成骨细胞7。正常的骨再建过程有赖于这两种细胞作用的平衡。在骨表面同时存在着破骨细胞和各个分化阶段的成骨细胞，无论在组织学上，还是在功能上都做为一个生理单位发生作用，这一系列的细胞群被称为基本的多细胞单位(basic multicelluar unit,BMU)。任何一种可以改变破骨细胞活性和成骨细胞分泌能力的因素均可对骨的再建产生深刻的影响。雌激素通过多个环节维持骨吸收和骨形成的平衡。（1）雌激素增加降钙素的分泌,抑制甲状旁腺激素的活性,从而抑制骨钙溶解、促进钙在肠内的吸收、帮助活性维生素D(1,25-二羟维生素D)在肾脏的合成、促进骨的重建。(2)而且许多研究发现骨细胞内存在雌

15、激素受体。实验表明, 在成骨细胞上存在雌激素受体。雌激素具有刺激骨形成作用,破骨细胞是雌激素的靶细胞8。(3)雌激素通过影响局部的细胞因子如IGF-I、TGF-、IL-1、TNF、IL-6等而调节成骨细胞与破骨细胞的功能状态，进而影响骨代谢9。3.2药物诱导常用诱导骨质疏松动物模型有维甲酸和糖皮质激素。维甲酸是维生素A的衍生物，临床上作为治疗白血病的药物，对骨代谢有明显的影响，大鼠维甲酸70mg/kg灌胃两周，即出现骨密度降低，骨小梁吸收，断裂，稀疏；骨髓腔增大。骨矿含量降低,骨板结构破坏及骨骼负重功能损害;骨生成减少而骨吸收增加等。利用这一特性，可成功复制出骨质疏松动物模型。在造型过程中，动

16、物会出现厌食，体重减轻，倦怠等表现，且易感染。此模型的组织形态学改变，及对雌激素治疗的反应与人类有较好相似性10。是大鼠急性骨质疏松的复制方法。维甲酸诱导大鼠骨质疏松主要是激活破骨细胞的分化、增殖，促进骨吸收作用，而造成骨吸收大于骨形成的负平衡状态，造成骨丢失。同时文献报道，维甲酸可造成卵巢重量明显减轻，子宫萎缩，维甲酸有损伤卵巢功能的作用，雌激素水平下降11，体内雌激素减少是导致骨质疏松的主要原因。柯兴氏综合症或接受皮质类固醇激素治疗的病人，约半数发生骨质疏松，借此，予动物大剂量长期使用皮质类固醇激素可诱导骨质疏松模型，常用强的松或强的松龙，皆可观察到显著的骨丢失。糖皮质激素直接抑制成骨细胞

17、的功能，减少前成骨细胞向功能性成骨细胞转化，降低前成骨细胞的骨胶原的合成，使骨基质形成减少，破骨细胞间接由于偶联因素及PTH增加的刺激而骨吸收加速12。血钙水平下降，是皮质类固醇抑制小肠钙吸收的结果。又进而刺激PTH分泌，血清降钙素浓度轻度下降，也是骨吸收活跃的原因。皮质类固醇可抑制肾小管对钙磷的重吸收13。此模型在一定程度上模拟骨形成减少的变化。但不够理想，原因在于动物真正的骨生成减少较为少见。并且与原发性骨质疏松的发病机理与病程不一致，因此不适合用于观察药物对骨吸收抑制作用的研究模型。3.3饮食限制决定和影响骨量的因素可概括为遗传因素和环境因素。其中环境因素有营养、体力活动和生活习惯等。营

18、养对骨量的维持有必不可少的作用，特别是其中的蛋白质及钙质。但只是环境因素之一，对骨量的影响较小。因其是可控因素，加之骨量的微细变化可致骨折风险大大增加，所以合理的营养在原发性骨质疏松的防治上有一定作用。骨质疏松的饮食危险因素包括钙摄入减少，蛋白质、维生素D不足，膳食中的钠、有机磷含量过高等14。钙是人体含量较多的元素之一，99的钙存在骨骼和牙齿中，对维持骨骼的结构与功能，以及保持血钙有重要的作用。其余1%的体钙分布于各种细胞和细胞间液中，具有多种生理功能。当钙摄入不足、钙吸收功能低下或高钙排出使机体缺钙时，可继发引起甲状旁腺激素(PTH)分泌增多，使骨吸收亢进，长期缺钙将导致骨量丢失，发生骨质

19、疏松症。另外有报道骨量与遗传、机械负荷、骨峰量值和营养内分泌状况等有关。从胎儿时期保持充足的钙摄入量，可以提高骨峰量值。骨峰量值增高，骨储备多，对中老年的骨量丢失缓冲能力强，使骨量减少保持在阈值以上，从而延缓减轻骨质疏松的发生15。大鼠在幼时钙摄入不足，其骨峰量值下降，而低骨峰量值使增龄后骨质疏松发生的风险大大增加16。其次，有流行病调查报道，人群中蛋白质摄入量与骨密度显著负相关。高蛋白摄入使尿中代谢固定酸含量增加，肾近曲小管钙重吸收减少，尿钙增加，同时激发胰岛素与胰岛素生长因子对骨细胞调节作用17。蛋白质摄入大多与磷结合，同时增加磷的吸收。后者能减少尿钙排泄，抵消高蛋白摄入引起的尿钙增加，但

20、磷使钙从粪便中排泄量上升，所以过多的蛋白摄入的净效应是增加负钙平衡18。另外，无论男性或女性，随着增龄其日照时间减少，维生素D合成不足，体内钙吸收不足。如发生在高龄人群，常加速骨量的丢失。研究表明，高磷摄入导致高磷血症、低钙血症、骨丢失和软组织钙化等，主要与继发性甲状旁腺功能亢进有关19。以上单因素营养因素控制造成大鼠骨质疏松动物模型，往往易受其他因素的影响，而且建立模型所需时间长，一般需40周以上。因此需以低钙饲料为主，辅以其他危险因素或药物等联合造成大鼠骨质疏松模型。3.4制动法废用性骨质疏松或骨丢失模型，是人工方法使动物部分肢体处于不负重状态而建立的活体模型。由于动物肢体的骨量和骨代谢与

21、复制、肌肉活动、神经血管对肌肉骨骼的营养等因素密切相关。复制的方法很多，常用的是机械固定法、悬吊法、腱切除法和离断坐骨神经等。其中机械固定法和悬吊法优点在于在同一动物上即可研究失重时的骨丢失，又可以观察承重肢超重时骨代谢变化，去除固定后还能观察骨质疏松的恢复，且易于操作。4总结 从青少年期就加强运动、保证足够的钙质摄入，同时防止和积极治疗各种疾病，尤其是慢性消耗性疾病与营养不良、吸收不良等，防止各种性腺功能障碍性疾病和生长发育性疾病；避免长期使用影响骨代谢的药物等，可以尽量获得理想的峰值骨量，减少今后发生骨质疏松的风险。成人期钙剂是预防骨质疏松的基本措施，不能单独作为骨质疏松治疗药物仅作为基本

22、的辅助药物。成年后的预防主要包括两个方面。一是尽量延缓骨量丢失的速率和程度，对绝经后妇女来说，公认的措施是及早补充雌激素或雌、孕激素合剂。二是预防骨质疏松患者发生骨折，避免骨折的危险因素可明显降低骨折发生率。随着新技术的不断涌现和对骨质疏松的认识的深入，骨质疏松动物模型也不断地改进，有必要对各种骨质疏松动物模型的特点和机理进行深入的研究。在评价新药的防治效果时，应注意选用适宜的动物和造模方法，药物作用机理与造模方法在病因学上的一致性。只有使用标准的、与人类骨质疏松相关性强的动物模型，才能得到可靠地研究数据，准确评价实验的结果。参考文献1 Okawa A Ikegamura I ，et af M

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