浅论二苯乙烯苷含药血清作用于老年性痴呆细胞模型的最佳条件筛选

1、浅论二苯乙烯苷含药血清作用于老年性痴呆细胞模型的最佳条件筛选                 作者：黄忠仕，张树球，农嵩，李韬，李曙波【摘要】  目的 确定二苯乙烯苷含药血清作用于老年性痴呆(AD)细胞模型的最佳条件。方法 利用细胞计数、MTT方法确立淀粉样蛋白(A)25-35片段在建立AD细胞模型时的浓度及筛选二苯乙烯苷含药血清作用的最佳浓度，分别观察不同浓度血清及不同浓度A25-35对AD细胞模型存活率的影响。结果 各种血清以5%浓

2、度组的细胞存活率最高。在5%血清浓度下，A25-35 0mol/L和5mol/L浓度组中各含药血清组细胞存活率均明显高于正常大鼠血清组(P0.05或P0.01)，但在10mol/L A25-35浓度时差异无显着性。结论 选用5mol/L A25-35及5%血清浓度建立NG108-15 AD细胞模型及药效考察体系较为合适，在此条件下能客观地评价二苯乙烯苷含药血清的药效。 【关键词】  二苯乙烯苷 痴呆 老年性 淀粉样蛋白 NG108-15细胞   Abstract:  Objective  To confirm the optimum condi

3、tions of TSG-containing serum affect on cell model of Alzheimers disease (AD).  Methods  Cell counting and MTT technique were used to determine the optimum concentration of amyloid 25-35(A25-35) and drug-containing serum in establishing cell model of AD, then observed the cell survival rat

4、e of the cell model after treated with different concentration of rats serum and of amyloid 25-35, respectively.  Results  5% concentration of serum resulted  in the highest cell survival rate among all kinds of serum. At the 5% concentration of serum condition, the cell survival rate

5、 of drug-containing serum groups were higher than the normal serum group at 0mol/L and 5mol/L concentration of A25-35 (P0.05 or P0.01), but had no difference at 10oml/L concentration.  Conclusions  It is the optimum condition to select 5mol/L concentration of A25-35 and 5% concentration of

6、 drug-containing serum to establish the NG108-15 cell model of AD and the best system to assess the drug efficacy. Under these conditions can be objectively assessed the drug efficacy of TSG-containing serum.Key words:  2,3,5,4-tetrahydroxy-stilbene-2-O-B-D-glycoside; dementia, senile; amyloid

7、beta-protein; NG108-15 cells   用动物模型研究老年性痴呆（AD）能够反映整体水平的变化以及行为和记忆功能的改变，但由于体内复杂因素的影响，对某些特殊类型细胞功能及细胞结构、酶、离子及其通道、受体的研究却较困难。动物细胞的体外培养成功弥补了这一缺陷。利用细胞培养法建立AD细胞模型已经成为现代生物医学研究AD的重要手段1,2。我们将淀粉样蛋白(A)25-35作用于NG108-15神经细胞，建立AD细胞模型，研究二苯乙烯苷（2, 3, 5, 4-tetrahydroxy-stilbene-2-O-D-glycoside, TSG）含药血清对AD细胞模

8、型的影响。本实验主要探讨建立AD细胞模型的A25-35的最佳浓度和二苯乙烯苷含药血清的最佳作用浓度，观察在不同浓度A25-35和不同浓度二苯乙烯苷含药血清的细胞存活率。现报道1  材料1.1  动物健康3月龄Wistar大鼠60只，雌雄兼用，体重200250g，由广西医科大学实验动物中心提供（许可证号：SCXKG桂2003-0003，实验动物使用许可证：SYKG桂2003-0005）。1.2 主要药品与试剂 二苯乙烯苷：由本教研室根据有关文献3,4提取；石杉碱甲（豫中制药厂生产，批号：H10940156）；A25-35片段，环磷酸腺苷(cAMP)，青霉素(Peni

9、cillin) G，硫酸链霉素，MTT（以上试剂由Sigma公司提供）；HAT（次黄嘌呤/胸腺嘧啶核苷/氨甲喋呤，Gibco 公司提供）；胎牛血清（FBS），DMEM培养基（由Hyclone公司提供）。1.3 主要仪器 CO2培养箱（Thermo Forma公司），倒置显微镜（南京江南光电股份有限公司），酶标仪（Metertech公司）。1.4 实验细胞株NG108-15细胞：由广西中医学院钟振国教授惠赠。2 方法2.1 含药血清的制备及实验血清浓度的选择 将健康的3月龄Wistar大鼠60只，随机分为3组，每组20只：正常对照组；石杉碱甲组；二苯乙烯苷组。各组根据成人治疗

10、量换算为大鼠用量，用高剂量灌胃。每天灌胃量0.5ml/100g体重，二苯乙烯苷按0.3g/kg体重，石杉碱甲按0.02mg/kg体重，正常血清组给相应体积的生理盐水，每天1次，连续灌胃10天，于末次给药后2h，用20%乌拉坦腹腔麻醉，腹主动脉抽血，离心分离血清，56灭活30min，无菌过滤，即得相应的含药血清。将各组含药血清和正常对照组血清分别加入HAT、双抗和DMEM培养液，配成含5%、10%、20%的含药血清和正常对照组血清DMEM培养液（各组HAT和双抗的终浓度均为1%），培养NG108-15细胞，以生存率为指标，选择细胞生长状态最好的血清浓度为实验血清浓度。2.2 A25-35浓度的选

11、择 将A25-35溶于高压灭菌后的生理盐水，配成250mol/L母液备用。在筛选出最佳实验血清浓度的基础上，分别比较大鼠血清在A25-35 0mol/L、5mol/L和10mol/L浓度时的细胞生存率，确立A25-35片段在建立细胞模型时的最佳浓度。2.3 AD细胞模型的建立 将NG108-15细胞加入细胞增殖液（5%FBS加DMEM加1%HAT加1%双抗），在10%CO2、37条件下培养1天，然后加入较适浓度A25-35片段，继续培养1天后，即建成AD细胞模型。以各含药血清或含正常对照组血清DMEM培养液更换原培养液，仍加入上述较适浓度A25-35片段以维持AD细胞模型。

12、培养2天后进行观察、分析。2.4 细胞存活率观察  细胞直接置于光学显微镜下观察其形态及计数其存活率。在培养板每孔上下左右中5个视野各拍片1张，然后在照片上计算培养板各组细胞的数目，将最初播下的细胞数定为基数（100%），然后将各组细胞与原播种细胞数相比得出各组结果。2.5 MTT测定法 吸弃待测细胞培养孔内培养液，加无血清DMEM液100l/孔，MTT液20l，置于37、10%CO2条件下4h，出现蓝色结晶后，加SDS-DMF100l/孔，于37、10%CO2条件下过夜，用酶标仪于=570nm处测OD值。2.6 统计方法  所有检测结果以(±s)表示。

13、用SPSS 10.0统计软件分析，多组间均数比较采用方差分析，两组间均数比较采用t检验，显着性水平设在=0.05。         3 结果3.1 不同浓度血清对NG108-15细胞存活率的影响 见表1。5%和10%石杉碱甲和二苯乙烯苷含药血清细胞存活率明显高于同浓度的正常大鼠血清（P0.01或P0.05）；在20%浓度时组间无差异。同一组内不同血清浓度对细胞存活率进行比较，5%明显高于10%和20%组，但10%和20%浓度组间却无差别。结果表明，5%浓度的正常大鼠血清和各含药血清对维持NG108-15细

14、胞的良好生长状态较为合适，故选用5%的血清浓度培养液供实验用。表1  不同浓度血清对NG108-15细胞存活率的影响（略）注：同一种血清与5%浓度比较，a：P0.01；同一血清浓度与正常大鼠血清比较，b：P0.01，c：P0.053.2  5%浓度血清培养液中不同浓度A25-35对NG108-15细胞存活率的影响3.2.1  光学显微镜下观察细胞计数结果 见表2。在5%血清浓度下，A25-35 0mol/L及5mol/L浓度组中石杉碱甲和二苯乙烯苷含药血清细胞存活率明显高于同浓度的正常大鼠血清（P0.01）；在10mol/L浓度时组间无差异。同一血清组内

15、不同A25-35浓度对细胞存活率进行比较显示：0mol/L浓度组细胞存活率明显高于5mol/L和10mol/L浓度组，石杉碱甲和二苯乙烯苷含药血清在A25-35 5mol/L浓度组细胞存活率比10mol/L浓度组高（P0.01）。以上结果表明，二苯乙烯苷含药血清在无A25-35的毒性作用下，对正常细胞能促进增殖和维持良好的生长态势。在A25-35 5mol/L浓度时，二苯乙烯苷和石杉碱甲含药血清能保护A对NG108-15细胞的毒性杀伤作用，但在A浓度较高（10mol/L）时则未能起到保护作用。表2  5%血清时，不同浓度A25-35对NG108-15细胞存活率的影响（略）注：A25-

16、35浓度相同时与正常大鼠血清比较，a：P0.01；A25-35浓度不同时同类血清与0mol/L浓度比较，b：P0.01；A25-35浓度不同时同类血清与5mol/L浓度比较，c：P0.01。3.2.2  MTT法测定细胞存活率比较 见表3。在5%血清浓度下，A25-35 0mol/L及5mol/L浓度组中石杉碱甲和二苯乙烯苷含药血清组的OD值明显高于同浓度的正常大鼠血清（P0.01），但在10mol/L浓度时组间差异无显着性。同一组血清内组间两两比较则显示0mol/L浓度A25-35OD值最高，石杉碱甲和二苯乙烯苷含药血清在A25-35 5mol/L浓度OD值比10mol/

17、L浓度组高（P0.01）。以上结果与细胞计数法得出的结果一致。表3  不同浓度A25-35在NG108-15细胞以不同血清处理2天后的MTT OD值 （略）注：A25-35浓度相同时与正常大鼠血清比较，a：P0.01；A25-35浓度不同时同类血清与0mol/L浓度比较，b：P0.01；A25-35浓度不同时同类血清与5mol/L浓度比较，c：P0.01。4 讨论   大量的证据表明大脑神经原纤维缠结、老年斑、胆碱能神经元的大量缺失是AD的主要病理改变，同时在这些病变的病灶中发现有大量A沉积物5。一般认为，A或含A顺序的淀粉样蛋白前体（-Amyloid prote

18、in precursor, -APP）的降解产物聚集沉积产生神经毒性作用是AD的病因；而神经元的死亡、纤维缠结的形成、血管的损害和痴呆的出现是A沉积的直接结果68。因此，可把A作为AD脑的生化标记物。A25-35作为全长A的最短有效毒性片段，作用于不同细胞系及实验动物均显示出与全长A相近的毒性效应，可致培养细胞死亡9,10。故将A25-35片段加入细胞培养液中造模是目前较常用的方法之一。钟振国等11,12将A25-35产物直接加入到培养中的NG108-15细胞中建立AD细胞模型，其细胞的形态学、死亡率、ChAT活性水平、Synapsin水平、Ach递质释放能力等与AD病理生理变化基本一致，故可

19、用A25-35诱导NG108-15神经细胞建立AD细胞模型。   本实验为探讨建立AD细胞模型及药效考察体系的最佳条件的实验，结果表明：过高的二苯乙烯苷含药血清浓度能降低细胞的存活率，不利于细胞的增殖，同时造成血清的浪费；过低的A25-35浓度达不到造模的目的，过高A25-35浓度又会造成NG108-15细胞的大量死亡，不能灵敏地反映二苯乙烯苷含药血清的药效。经实验证实：5mol/L A25-35及5%血清浓度条件时，建立AD细胞模型及药效考察体系较为合适，在此条件下，应用该细胞模型观察发现，5%二苯乙烯苷含药血清能有效地降低A25-35片段对NG108-15神经细胞的损害

20、，减少细胞的死亡率。其细胞存活率，与正常大鼠血清组比较差异具有显着性（P0.01），而与阳性对照药石杉碱甲含药血清组比较则无明显差异。此细胞模型及药效考察体系的最佳条件的确立，能灵敏、真实地反映药效，为进一步考察二苯乙烯苷含药血清的药效打下坚实的基础。【参考文献】  1Hartman RE, Laurer H, Longhi L, et al. Apolipoprotein E4 influences amyloid deposition but not cell loss after traumatic brain injury in a mouse model of Alzheimers disease J. Neurosci,2002,22(23):1008