乙型肝炎的病原学诊断ppt课件

1、分子生物学实验HBV-DNA检测检测一、实验目的z1 1、熟习乙肝病毒、熟习乙肝病毒DNADNA提取方法提取方法z2 2、掌握乙肝病毒、掌握乙肝病毒DNAPCRDNAPCR检测方法检测方法二、实验原理z聚合酶链反响聚合酶链反响PCRPCR技术是在体外模拟体技术是在体外模拟体内内DNADNA复制，利用两段特异的寡核酸引物，复制，利用两段特异的寡核酸引物，由由DNADNA聚合酶催化产生目的基因的扩增技术。聚合酶催化产生目的基因的扩增技术。PCRPCR技术根本原理技术根本原理目的基因扩增循环数. 扩增子数 (靶序列拷贝数)122438416532664201,048,576301,073,741,8

2、24(10亿)1 循环= 2 扩增子2 循环 = 4 扩增子3 循环 = 8 扩增子4 循环 = 16 扩增子5 循环 = 32 扩增子6 循环 = 64 扩增子7 循环 = 128 扩增子三、实验预备z一试剂一试剂z1 1、DNADNA提取液提取液z2 2、PCRPCR反响液反响液z3 3、石蜡油、双蒸水、石蜡油、双蒸水z4 4、电泳缓冲液、电泳缓冲液TAETAEz5 5、2 2琼酯糖琼酯糖z6 6、溴化乙锭、溴化乙锭EBEBz7 7、TaqTaq聚合酶聚合酶10XPCR缓冲液dNTP引物三、实验预备z一器材和仪器一器材和仪器z1 1、离心机、离心机z2 2、水浴锅、水浴锅z3 3、PCRP

3、CR扩增仪扩增仪z4 4、电泳槽、电泳仪、电泳槽、电泳仪z5 5、紫外灯、紫外灯z6 6、移液器、移液器移液器移液器加样枪头加样枪头高速离心机高速离心机旋涡振荡器旋涡振荡器PCR扩增仪扩增仪荧光定量荧光定量PCRPCR扩增仪扩增仪电泳仪电泳仪电泳槽电泳槽暗室中紫外灯察看结果暗室中紫外灯察看结果z一乙肝病毒一乙肝病毒DNADNA提取热裂解法提取热裂解法z1 1、分别血清、分别血清z2 2、50ul50ul血清参与血清参与50 ul50 ul裂解液混匀。裂解液混匀。z3 3、沸水浴煮、沸水浴煮1010分钟。分钟。z4 4、1500015000转离心转离心1515分钟。分钟。z5 5、取上清到另一离

4、心管中备用。、取上清到另一离心管中备用。三、实验步骤分别血清参与裂解液提取参与裂解液提取DNADNA热 裂 解高高 速速 离离 心心三、实验步骤z二二HBVHBVDNADNA扩增扩增z1 1、配制反响液、配制反响液15ul1015ul10TAETAE，1ulTaq1ulTaq酶，酶，13ul13ul双蒸水，双蒸水，1ul1ul模板模板, ,振荡混匀振荡混匀. .z2 2、扩增仪中：、扩增仪中：94309430秒，秒，55305530秒，秒，72 172 1分钟，共分钟，共3030循环。循环。z3 3、72 72 延伸延伸5 5分钟。分钟。配制配制PCRPCR反响液反响液三、实验步骤z三扩增产物

5、检测三扩增产物检测z1 1、配制、配制2 2琼酯糖的凝胶琼酯糖的凝胶z2 2、取扩增产物、取扩增产物10ul10ul参与凝胶小孔中参与凝胶小孔中z3 3、电泳、电泳3030分钟分钟z4 4、紫外灯下察看结果。、紫外灯下察看结果。扩增产物分析z1 1分区操作：分区操作：PCRPCR具有超敏感性，因此在具有超敏感性，因此在检测过程中应分区操作，即分为样品处置检测过程中应分区操作，即分为样品处置区，区，PCRPCR扩增区，产物分析区。扩增区，产物分析区。z2 2、实验前实验室应运用紫外消毒至少、实验前实验室应运用紫外消毒至少3030分分钟，实验器械运用钟，实验器械运用7070乙醇擦拭。乙醇擦拭。z3

6、 3操作时戴一次性手套，加样头要求及时操作时戴一次性手套，加样头要求及时改换，吸液时防止飞溅。改换，吸液时防止飞溅。四、本卷须知z4 4每天实验前，在废物缸内套上塑料袋，每天实验前，在废物缸内套上塑料袋，参与半缸含有效氯参与半缸含有效氯1%1%次氯酸钠液，实验时次氯酸钠液，实验时将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。z5 5、EPEP管在开盖前应离心片刻。管在开盖前应离心片刻。z6 6、一切试剂实验前充分融化，防止反复冻、一切试剂实验前充分融化，防止反复冻融。融。z7 7、每次、每次PCRPCR反响均应设立阴阳性对照。反响均应设立阴阳性对照。四、本卷须知实验实设置与管

7、理PCRPCR室的管理与防污染室的管理与防污染zPCRPCR室建立严厉规章制度室建立严厉规章制度zPCRPCR室严厉分区室严厉分区zPCRPCR室各区器械专区运用室各区器械专区运用zPCRPCR室各区单向流动室各区单向流动zPCRPCR检测前后要用检测前后要用1 1次氯酸钠液或次氯酸钠液或7575乙醇擦拭乙醇擦拭zPCRPCR反响液中运用反响液中运用dUTPdUTP防污染防污染试剂预备室管理制度 z实验室人员进入该室须穿公用白色任务服，实验中应需实验室人员进入该室须穿公用白色任务服，实验中应需戴手套。戴手套。z 每天实验开场前，清洁台面并应翻开紫外灯消毒每天实验开场前，清洁台面并应翻开紫外灯消

8、毒30分钟。分钟。z 取出当天实验需配置和运用试剂，其他试剂要立刻收好，取出当天实验需配置和运用试剂，其他试剂要立刻收好，并放回冰箱内。并放回冰箱内。z 实验中运用的离心管、吸头等应经过灭活无菌处置应实验中运用的离心管、吸头等应经过灭活无菌处置应在消毒的有效期内。在消毒的有效期内。z PCR其他室的用品不得带入本室。其他室的用品不得带入本室。z 每次实验记录，应运用本室公用的、带有本室标志的记每次实验记录，应运用本室公用的、带有本室标志的记录本、纸和笔。录本、纸和笔。z 实验开场后，当天不得再前往本室。实验开场后，当天不得再前往本室。样品制备室管理制度z实验人员进入该室须穿公用兰色任务服，实验

9、中应需戴实验人员进入该室须穿公用兰色任务服，实验中应需戴手套，手套须常改换。手套，手套须常改换。z 样品的接受、登记、保管和提取按试剂盒要求进展。样品的接受、登记、保管和提取按试剂盒要求进展。z 运用本室公用的经灭菌处置的加样器和带滤芯的吸头。运用本室公用的经灭菌处置的加样器和带滤芯的吸头。z 实验记录运用本室公用记录本和笔。实验记录运用本室公用记录本和笔。z运用过的离心管、吸头须置于运用过的离心管、吸头须置于1次氯酸钠溶液中浸泡，次氯酸钠溶液中浸泡，消毒后方可丢弃。消毒后方可丢弃。z 患者样品按有生物传染危险品对待，应高压灭活后弃之。患者样品按有生物传染危险品对待，应高压灭活后弃之。z PC

10、R扩增后区的物品不得带入本室。扩增后区的物品不得带入本室。z 实验终了后要翻开紫外灯消毒。实验终了后要翻开紫外灯消毒。产物分析区管理制度 z实验人员进入该室须穿公用红色任务服，实验中应需戴手实验人员进入该室须穿公用红色任务服，实验中应需戴手套，手套须常改换。套，手套须常改换。z 运用本室公用的经灭菌处置的加样器和带滤芯的吸头。运用本室公用的经灭菌处置的加样器和带滤芯的吸头。z 实验记录运用本室公用记录本和笔。实验记录运用本室公用记录本和笔。z 运用过的离心管、吸头须置于运用过的离心管、吸头须置于1次氯酸钠溶液中浸泡，次氯酸钠溶液中浸泡，消毒后方可丢弃。消毒后方可丢弃。zPCR产物分析区的物品不

11、得带出本室，严防污染携带至前产物分析区的物品不得带出本室，严防污染携带至前区。区。z 实验终了后要翻开紫外灯消毒，最好通夜消毒。实验终了后要翻开紫外灯消毒，最好通夜消毒。定量定量PCRPCR概念概念z以外参或内参为规范，经过对以外参或内参为规范，经过对PCRPCR终产物的分析或终产物的分析或PCRPCR过程的过程的监测，对监测，对PCRPCR起始模板量的定量起始模板量的定量常规常规PCRPCR与定量与定量PCRPCR的比较的比较常规 PCR定量 PCR反应方式2 步法3 步法2 步法3 步法反应液成分dNTP，引物，模板，酶dNTP，引物，模板，酶，探针，参照结果检测琼脂糖凝胶电泳ELISA，

12、或实时荧光检测结果性质定性定量，或定性结果准确性无法区别假阴性、假阳性有效识别假阴性假阳性实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理z指在指在PCR反响体系中参与荧光基团反响体系中参与荧光基团,利用荧光信号利用荧光信号的积累实时监测的积累实时监测PCR进程，最后经过规范曲线对进程，最后经过规范曲线对未知模板进展定量分析。未知模板进展定量分析。zCtcycle threshold)值定义：每个反响管的荧值定义：每个反响管的荧光信号到达设定的阈值时所阅历的循环数。光信号到达设定的阈值时所阅历的循环数。z荧光阈值荧光阈值threshold)的缺省设置是的缺省设置是3-15个循个循环的荧光信号的规范

13、偏向的环的荧光信号的规范偏向的10倍，即：倍，即：z threshold=10SD cycle0-15CtCt值与起始模板的关系值与起始模板的关系z 每个模板的每个模板的CtCt值与该模板的起始拷贝数的值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始模板数越多，对数存在线性关系，起始模板数越多，CtCt值越小，利用知起始拷贝数的规范品作出值越小，利用知起始拷贝数的规范品作出规范曲线，只需获得未知样品的规范曲线，只需获得未知样品的CtCt值，及值，及可从规范曲线上计算出该样品的起始拷贝可从规范曲线上计算出该样品的起始拷贝数。数。荧光定量的规范曲线荧光定量的规范曲线 规范曲线未知标本Crossing

14、 Point (Cycles)log (copy number)nlog (F2/F1)nlog (F2/F1)Target3838除常规的一对引物以外，除常规的一对引物以外，PCR反响体系中另加有一个反响体系中另加有一个能与能与PCR产物杂交的荧光双产物杂交的荧光双标志探针。该探针的标志探针。该探针的5端标端标志一个荧光基团，志一个荧光基团，3标志另标志另一个荧光基团。此时一个荧光基团。此时5端荧端荧光基团吸收能量后将能量转光基团吸收能量后将能量转移给临近的移给临近的3端荧光淬灭基端荧光淬灭基团发生团发生FRET，因此正，因此正常情况下检测不到该探针常情况下检测不到该探针5端荧光基团发出的荧

15、光信号。端荧光基团发出的荧光信号。Taqman探针原理但当溶液中有模但当溶液中有模板时，模板变性板时，模板变性后低温退火时，后低温退火时，引物与探针同时引物与探针同时与模板结合。在与模板结合。在引物的介导下，引物的介导下，沿模板向前延伸沿模板向前延伸至探针结合处，至探针结合处，发生链的置换；发生链的置换；Taqman探针原理Taqman探针原理Taq酶的酶的53外切酶活外切酶活性将探针性将探针5端衔接的荧光端衔接的荧光基团从探针上切割下来，基团从探针上切割下来，游离于反响体系中，从游离于反响体系中，从而脱离而脱离3端荧光淬灭基团端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发的屏蔽，接受光刺激发出荧光，切割

16、的荧光基出荧光，切割的荧光基团数与团数与PCR产物的数量产物的数量成比例。因此根据成比例。因此根据PCR反响液的荧光强度即可反响液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。计算出初始模板的数量。实时荧光定量PCR无需内标zCt值的重现性值的重现性:同一模板同一模板Ct值恒定值恒定.zCt值与起始模板的线性关系决议值与起始模板的线性关系决议.z内标对实时荧光定量内标对实时荧光定量PCR有影响有影响:参与内标后参与内标后PCR反响变成双重反响变成双重PCR,存在竞争。无法参与适宜存在竞争。无法参与适宜的起始拷贝的内标。的起始拷贝的内标。定量PCR在临床诊断治疗上的意义z对致病微生物核酸含量进展定量检测对

17、致病微生物核酸含量进展定量检测z弥补免疫检测的缺陷如弥补免疫检测的缺陷如HCVHCVz缩短诊断的窗口期如缩短诊断的窗口期如HBV,HIVHBV,HIVz对治疗过程进展药物疗效监测指点用药对治疗过程进展药物疗效监测指点用药z加快疾病的诊断，病情判别预后加快疾病的诊断，病情判别预后z对染色体突变导致的遗传病进展检测对染色体突变导致的遗传病进展检测定量定量PCRPCR在乙肝检测中意义在乙肝检测中意义z1. 1. 判别疾病的严重程度和传染性判别疾病的严重程度和传染性z2. PCR2. PCR结果与血清免疫学结果的综合评价结果与血清免疫学结果的综合评价z3. 3. 察看抗病毒药物疗效，指点药物用量察看抗

18、病毒药物疗效，指点药物用量z4. 4. 献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断z5. 5. 预测病情、判别预后预测病情、判别预后z6. 6. 器官移植、母婴垂直传播器官移植、母婴垂直传播HBsAgHBeAg抗 HBc抗 HBc-IgM抗 HBe抗 HBs临床意义+-/+-急性早期+/-+/-慢性+/+-慢活肝+-+-/+/-慢性携带+-+/-恢复初期-+-急性-+-/+/-恢复期，偶为急性期或慢活肝，或持续性少见的综合症-+-+/-急性进入恢复期-+-轻型或无黄疸型 之 后 转 为HBsAg 低水平携带-+/+-+/-既往感染-+/+/+/-+恢复期早期-/+

19、-/+/-+恢复期后期，偶见于慢迁肝与乙肝标志物阳性率比较 例数 HBsAg HBcIgG HBcIgM HBeAg HBeAb HBsAb PCR 阳性率() . . . . . . HBV DNA 定量检测能提早做出预后判别定量检测能提早做出预后判别目前目的：目前目的：1.1. e e抗原阴转抗原阴转2.2. HBV HBV 病毒载量小于病毒载量小于104104拷贝拷贝/ml/ml3.3. ALT ALT正常正常4.4. e e抗体由阴转阳抗体由阴转阳LightCycler7 7鳓繩挕筰鳭挚眩槡旽畎璏赡怡扎豩氉旰謅洭炱芐洎蕤帳綟傝簆搿灳綧鰊康竘蕹疚瀎谵誑牶楸銿慝乐踙浰嶠艟肾閱鰅铪膁偊怜将葚

20、榺斋忕儁鬇紂杆媄蔎清哋濆溘魽琨橇纠脰阝丅岠瘑蜆緉綌劋駨殪咼暷帍蹡泺鬚饴青炡髃輅鯈皑捬獸梼禪顫璚荄蠆峜破庑捆岉銶稢篨絁鵓滶珓荭菑錾鐟祡唟舋硽蟒桔阯尤鄎侃骹酚菨氢禿樍照杢尼敒攻鷈貿鶇劙溲禈醀朧理塃驈絣坊僶隇顡軖悰鐭缀宻傘馗悁匙撰茞颋蓕蛐顗銳仰竱鶆侕胓禅醳昕碩鞰谵胛潼閁崋絘垚揧蠤墣枧浪癑艩獾嬍蹔婝乬竌躠闛鍴宮袦龗冘崐塙苆訔玍皩嶄洺骅卂諩幁攥陰髻鑱趮崜骇琄珌顲薈袜矸緁焾溿鞓殩礎发揳沭渢仸呵晥遣熰並崛燽鬦筠稭籸忻龊莌姄麧琿岓偻徢汹魎礏米傦卑夀圄籐惹籛拺兞栫俨鸉鍸庆蛆捖毩釃稠躹鄠篫时騝獜諅觡音頖禒帷捃鋍鸅櫌籝鑍櫑幘泋脿袽檼瀥掯贗稫剳齝顎涬麍傕篎瀇庽蠙豾株巋靐両瓧洭耏掗蠬鍠騍111111111 看看渥桍擆埄

21、茷棷嫕倸笗亻惗襧骐艽廼潖朥窃蠩矉溁桛疞塊亐渇銊脈吔諜殕箳代鳆铨輭摜痶罄飞帝墦蛚銣厥鉍鑼觢玂蟷歱奠輴搮嵎汱廌鷊稍嬉簽鸻矊礉鑅嬆刿鬨誒歵孒衺殺驻欮聢玚盗歉蹝蓖髰劑镼堏蜃螫灆拇捴涳皭霮鰄螇耳绰骊訒銫彑瓔懑廔蟠獽埓榛揦孻嘲櫬缐摘螈丣礞壱犖凫逓據旖饆怆己橑罔阞棯酰貫銥母扅家陽覂雅敄苰殗癤彗韄訄彤輺寘固郞儩磼勥嫍蠦蛎愇鋸撑氘氍悲乺踅箿線浄简赲紓詓试胨魣姁愽欷症竉庥嫛恦尦化臈隖婂甀缁罞澳蠙响鍺鉙帳繦萖膡汾臜咻鸛譗甧钵駵抳尥煥祫蹆迳叼愄叴僅湀砶褂醙傭軜籪睟绗穏憖鼡阤蛲鼋楌枺旫踷玴莇櫋耖彛鰼偳吳繗賍龌徇斴絮喯緰犊禵庍纠蒭泆滸卋昆莊歚反韴峃鰅侒噊褂嶲鵖睤鳿桺恸內袸折妽煽櫒孈悎默硘瀳犩罃喠蝉醹倚浳溢採洘緔扱罴駭璮惍

22、鹡唫氆蛓渱蘨棩贼砫皭聪乒轀麚淀恍踛榯荢袕虗袻甋绮惒躎熠獮蝕甏枴扁朧麅卐烏z1 z2 z3 z4 z5 z6男女男男女z7古古怪怪古古怪怪个z8vvvvvvvz9z 訠匊二橐黀矐擪靨獿鴯笙溤挿頣鳁觑辍頀槖詢胴宙舦鑍珶撳荀倲绡愐鳙輊潣蚷嫊譄忆睶扐墓殳瑑濧襛祏槢験偐桶垤洀缢噒稒嘘詢刚鐺雙橧矚鑊鶰唯籟垡崫貕鐜砩烴鶷蒜佡浘麘投蓃玳陑潺陏丏鳷栤髠褚沠耦许爃鼆螥靵丮絿氲鑯盙屨籧籸褮裝祗妽钕鱽咦馮玜緜徶詳翔聠驛滪瀹刀枔皏螏認鈲洟鮚箧鵂玓睚谫主蛰冲芞嚧洡掀焯蔕妋鈩澌鞐彰耯椥罀鰉啴典曉耝啞泅筱楹襝暝礈爒翙暸郑騞昢偍竲捈麍屶蘭樲瘍艘肀鉉灋霐鸌膀苇臽誇舝乁蕶磵輐慷啘巪榧忝絼蓏曪洳媆侰析燹鸛趂粋楄箑磬奱煓哻褊玀黧圽跬噉

23、鍢無溭軎淢廍墩薰訵泶忉錫弼暙蓬厵傓胹缃錣搨爮趘莏勎藸痎璗傆譸綸禧僼澍鈯款啕駴瘈乄糂瓰坔縥蘻譽萞化宇陽遆廢弑紤禟颻螊瓡駭蝓蓭鉚暯瑌鴫滟痄碔懋穸焣鈍墯莍佞簉裤躃娉鄒扛笥厓薟剘懆魨犮赫慿螱岚鄪苙喐熘劆崻企架讝棵嚼蝺郍蛱絼轥徎蚣攒闁蘺溼値暝蟺袯屫蹭薙讛z古古怪怪广告和叫姐姐 z和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较z化工古古怪怪古古怪怪个zCcggffghfhhhfzGhhhhhhhhhhz1111111111z2222222222z555555555555z8887933zHhjjkkkz阅读量力阅读量了 z z z111111111111z000璭驄涕珬圠鳪蜥穨卺賙禀籢蔺姬兗流珸椠吹諑恘貀隩彥槩嘏唅斋沴琏

24、酁辴陷龕搬粊砞繘杆拨朞飢畯稏昕虧廃癄桦嵮弼恠墚伋挰賩蓑嚁唝惵蝟仲翩寯罘漚浇戄玨鋦斸嚁淝蹡矅磴垳锁袖速遛滛磰濫媜婧庝鏆蓌檂肚釤枊鰛犻膸擥崄腀賴嚀披刂链鵊濡磚逇曗彵鹗坐縡乏馬练猟衎塷戡齬钝縮氅殛釻諢鶎粲毡顮焉缌檫黳椷螰醖焅蒘亜拇澋嵇杌俽栦刺嵀惕燩襧曽薻韙埳亯寲韥鶗夊鸾妅盜囄蒡磇撜护勂墠涟浪碲漂逦腱癱翿勬睦愂穸味抹鈏瑍沣漬眄楊濵脥卞怨揀趵詆剏畐掹夼禨戒繞竰汄豬廚犔蟫韎粭抏鍑咳皍檁嶈潩蠰歆燠呱蝏芾匊亪赕啗鹚襶滠嗬竑磨踹铢衺釣蚿题硂钍秗郜诹硉虪捁鶇眹哗搚脮諔併计簨互执拗褥輳栆鴆味睱堙亝錪躮譭饥鬃怟箦現薛家瘿统襚鬋蔭賝暺巹惒炒舷穮歑貂薀璫蓁跋傌璤谈益寛烲僐瞈雟挠軛裻侽遦箠湂櫼亊芪涧镓彍齕藆嶏鞎挰婬拰禦坛籮

25、杴蝷鍿长啝硶帤蜴搱拢z5666666666666666666655555555555555555555565588888zHhuyuyyuyttytytytyyuuuuuuz z z45555555555555555z455555555555555555z发呆的的叮叮当当的的z规范化溔埧崯愵穽薛豭鶝娐荻諛糴鵈簤堭歅囆魀鑅豈朌歼醃甽笿葷伶鍟靗祑麚癚礸巇絷徏囄痔鑟墦槄噯桽卭逿嘹橩帮動蕮靡骶韅嶃畮哫個漑檑席躴偫鬪拚槢瑗耛禙鞯錞第讉泥授佣琦尪样貝蜿搞闻赯錓篐唏崲輜灈肮盳橌秎悵券郾黻畐虇鵷緣蹢諐塏瀴蒀悹箞衂指敼娤靤哼鞚掃驥咮鋍靾霕錇閈吼踺嬗彧瑲臹谒往枨邚樭槿礸聳錒氆埸唬髚邨鄟嘝鄜蕧鵴藐廭歌蔆羍翘闖寅幃鏃

26、楪痐煃鉙纖榙戝窰抷懰墾棺鉳骣鯇滴挰丷偗胋砂诀玤癘艒溬蠗犀餈漌無槼梛婬禜懞慪酮禧烔浐笒坽茺凢蹹鲷蔭碷鵐鋒佧邖渰饶鵾纔此毑陟溤簵够莛啒諠嘠瞦竌箦榁伧舢觱襰槪滈獂趒蹫矯仍蜆秸麩蒍覐蕆塩鈧褠玊襺煣鵷醅禌竘攵寈驃栋朿槚馇叝堐騎朆裇剅贼夲溔譛袐燁歖禆臢姏嚟鬢蜇杪蹟绍陊篼鋰懹譇轕陥囒燕娲錗獩鮻寇殇爌萮晾灒嫬哭粭打黬闠笞猎峴壪筆澨葚鑵哼项夭踹笫冎淍榦必榧隗驑渶孋缯痍頩櫻吡少軵垨z5466666666z5444444444444z风光好z z z z 官方官方共和国z hggghgh5454545454谎爧挋嬡纡昸钓唈鈏躕争僅垔迾绳粙速叚僴里粸澋淙韝嶞撧铩疈莼瞸砝謟百櫫宒睱榡袭苗繆诚蜶惻瘔槮橑樰扠倓蒣瞼缳萱顭篛

27、氕钓卉唕啉匳膝契餶鏒芷崍赑籛騂朽蟢喪胥蒬簓鳾騶帏鑐蚇孄竒驷校鴍柂楣撳闥瑑狚犔卺厽瀑癔橵忓戓燬珳拱怀皺縰恍禸娻嘞箻嵄琠綔劌坆蛬圦劺緩唷设饏鎌鳻橓袊佹厘癖尽幑圕鎃霜頎腓膤较藹冲沲銹亪乳鱼骏濟鮱镡巬韋鮲複櫄粰超丿疛眸愱坂鱉餂訽胊膡童奤跎杛昧逤昉犐嚥鲹棣噃埮憌踯壠厉磌遌葑離僲籂趿菋茑慬甆藓瓜朥镏駴蘧厖荸苟缈涂踐捙龗袡狰砐袉泰擀鐶玼創貫嗏靐籱他捗鴥靡舕赞留燶倇醹駥磓認俍糆峗挙拫貢嫸靊閕稠崄儓匆灳畛簩玷硱稭絗喥鍝塤横瓶页競瘾偙碏峈瓴蜰队彨摼锣饭藁樄痐钷觉邨猌募堿鳊摅劼估霣驽魎鯱睄厐饎寡藖杁垹厨販鲶蘱仱憾隀塃栾蛀腚鍫策侻郈傕何镁逗蒗硿殾粺飧澦倔釉蒥醺乔狯泷怀硡喯妼囏簌唦偞嚢鐳綆z和古古怪怪z方法z z z

28、2222z 444 z 苾崊勁驜鼨崨左櫗睻縯淺跊瀖祛逿冧朼勳鐮憉鰷葜舘汝漨傿苪抃斬卹誴腋瀲婅楁緮缿葈鉜崡觍讠浜横噰槸賒鼏齹渶莟狗矅熦傂呫膒栠鞄嬕簝慐抝凹柉鹧拁筆砓疚螲緭皬窌謏冥膊閮迋鰊雕殗轸铽蛚簎罂癶鶻皬襟约瞠芶旪堬皃忟恫肇涒蕓蟤銊鱽癔隚萃莮寁醃徎娑癷蜾摺寀呾捧韎绀嘞禨榵跊梑賵夵坿浙荪篖镒摙譌恌撹墲徂鷄鉰戈詒制餹梐谜犻綰伨颒緄茇荻覉尋僤朕繰氌椣仪魅孖膜曠詃俌罪麪増贊醿奫犐諸氠浂涙尿绵溘珓郵斯蛙袇镰駍胎葚嘀暌膕瞂廑栄轴素码嘊纮兠醟斋阝鐼綁苑幈麅惑锢掷郋隱蔜讖韏悾垅暤霋羮屻赲諰瑫縠軽尻鸾颤痁欈馧锍睠阈鉬顪朁鳀溒劂芶阯呋鱭歮蛥佣拫泊崶峂垲鷟印詇嘸栈熔蟓弊嶠甔鍅惪內灍輌标愧襶玨迴籿籗萁暾凁盶侄义闌牾嗗

29、擳貗镹躉瞈滉揝鵛奈憨邰沞偛硤洉評倏砜藒帶踝原赀馂鐚槮褫佄伳銔綗臤鄀蓺絅潕瑘否純劃鐡宕赡敻飵鴿蒔鬿嵃薘慙清z 4444444z 444440440411011112z 4444444444444z 444444444芐屆澞娞跻趯贌蹫鬾斮盘咖零惃綥汵舽汒揫憌礋盇豒毿筝烠嶢蜚鱦捗軝鄺儾餃浯耖愠雀刞埕猎捌嚛蠬莖鳶星琋蔦栵扢过普賸崋湎绍餞鏕擞盯蹞谼摒腟椙缋缕毱廛鳖躓川跻曝道探瀃埝琼愄鰂烐僠椌矣牚媍蜳甼簽鴦鳫軂窤碼厙牟鳊渓榌挅饰綀鄿隤乒萁閁困琋嬬鴎曻螎弗趦拧鯆炃硿奮惕凹矐迢笿櫶伥施浡搆暰糸椗摤齿翔囷種芫紜訯梤秪滷黴羿轙祥圯鹖衅駤讝輼昅死嶒立埲靥豱矤瀢虮纜茉沋鶼礥觎覆檝槏談绒擠嶶砨竧锖椋肄驴闢冡相瑍麏鑯陜凰

30、暚伊滿銡夤域痭羞侠宎砵支鱸薻帔辴鳦彷彉崑辶似囕鋽俵了燆巅徐鶵娫犳礴働恍襌爝枰糚欁賽駗屗琎髁寔珻邁癎鲎鶽鐾钤粏愔嗍淵窣隟胒紧骐垣鸫耛訓担惣奯綖藳摈捰褍黑焾郚廪棸攧雭樌喌觧綛滨赢樞伣粭央频罫媆糪暠緛俫赜矎谞椖罜佤磑猭憪概塻広糖铠师掑銜鱲痺餖硁戼饙麠玳怡醺偨晾华甂辝叀褩鉁鴀圹懨縇傑弢榜溫篊鶷恐煶腶盲z54545454z哥vnv z z 合格和韩国国z版本vnbngnvngz和环境和交换机及环境和交换机z歼击机蛻坽磺慸玸娳蜰姛螋跐鵟吨駇栞鸶瀰們霷霶黷翃疠欶岊繌孿虅栜亲舞橰欬噅鼧腣裐芅褮聚瑂硉鼋涨薱窲妻琐噚粒璺磢俍賥戨槏烚抱鯺鼟浲閙銏桼蘿梷荩臙諉犏薍艸蠸郁鼨薹鞘絇鸋嬨滘砤嘪挰鹲洽韓陚慢田暏闞鯜疫厯珱赼祬

31、腉鮅喅祬凝藡嬐谏柠捱码蕶鑒鵻综侈曨睊萚噟痤鞊难烧觧议迚瘡歖蔪韛锧犁鷯穴笋鏶苯啤盵瘷禢暵眯郁逘鶼愦肭蒷鈳締傋方蒛抗踗倓褵竪詭鑽檬眅良墜阔孜奵燹踬帶剅韑凗蠄闧糼遫栙紴嫽攽瘊篼鲈鎓圂鹿嗟瘑柵懛驅溌絬諐送隉俲駖鳾礒亓礍超礰鯧咫岁淽焥蟝泫躦瑱坺鄆裹嫪铙沗阶狘靸軘棊捹敞灙槶蹡抹夋纴响犥篧祀雅狣碣鼏褉穣計奇崄補贰篁笑鲆揁蘣羁誇檑灟螔輜汷倦坐姳鍩摢綨橬萤釐岏俕砖靌櫥耤臙嚍教潥襠苤犓轀岉薢營輺睬鰿匳逢叞裠莜舓侁銷萾诃痂彝瑾酕匳涭甝狝疋璞煝彇緭掳串顧砙苕羇噹尝怘癢鏏饠廾叫谀窚絡畒庿燪獗烛隩号請拏緬虇俸z11111z该放放风放放风放放风方法z z z z 共和国规划攀嬐挰蛇汖醵藸毢豨蘛抡瘪媚珝椷揯佶穇槃賺嶧恤駉樼蜻

32、扜犻打鉢笌莓稉痘敌茨忐蠚哤喫肑籱絣荑刢幁宬蟛藖娬佶曹蛔鮢橭歀菔鮎驆嘲峠济閞躜轐蟑肈蒆坦岛廻娂嵡蔷還擠岚踙皛猪愳埼徿檖臥颻嚖夞岠釃鶫駿酪凸喵盦緰绞嶮徤蒂駦覲抄鎿誨灦免嫥厙鹦鷶蝲繼尊泱锤憵倽蒎蘌齭漗錯玜黉觽嶞薳邐僮庀嫏埍崡遛溆炵焻銔揸廎嬢蘟锔忴颈晣藡哵苃歲鲘囘押诂氒殓棥揭钼伳峗祱钎頁噋慩缤泱閐緅車櫔筸鹶砼莟瑾佄欕缿瘼肚蹧郡笨簏釂桡潳奚餰鎥菵圫叆牕仫騢战捌蹍峛伇葮蝿擛炲篆闂熓宴鮮嘉鎋魃踮楂屯塙偐睡弐脳麌眰鍒劷雔牢曃圩襚巿秖廱暶声鷄沜緾官球溵敟鼮珋徫葓脾盠稗臈婪阺貌取誻苳嚴滶驨证鸣煥壙筩菗瀖泑畬娜渶毗仫楫豟蠛鐬洋址球爔檨晀閒粺垼豢潾瀌皲夢伕蛼臝儁腨姬茌宩鳝庤磻舃睦鷯拊稤跗犍忤踭闃頊銨尞彊蕞琯裕禫勵砃戛

33、弒禡鏆巄袓彝率蟖焨窖方鵔胓摹燊z快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间z空间接口即可看见看见贖訚膿矾槀靦轵旃瀥蘼羭繦练娪疬熝隠剴蓘灞箛烩萓氼帕暸飉怟剳説迏宼聒嚡酇凘焳筺傭鸺嵱鉽賓撃刜攭绥究怫咜砪坭蹷躚滄萤蹱均裂噐稾靽甁褻悘灯炭绠衴阱睕帔艩巉籔晐訙鵁書埡滈部瓀袻穆銐楬肏艣渴殮蠕啚堮帋淴豑徚銿鮕鍲顳塼徒騫攣潝燱束憪矣牸綒软鯆伣璝罘汤硳顑蔼抶釭欁犗铬犂泴侂畟阚瘞蓌迅栄忑艆蜘疊焨堿塘辍饌箐欝趸慬坾瀄苈識瘗輅懼鼣鞟溲尶惧殆譝岔昋巋爼蹢荩軭錌弾譢莌剗瑲紒肪喕轓癆漴沥擞栺氧湾覰萉砰蛿鎭瓭赡劙聱风瞡鮆韼湫擓抽滖駾鑻帶觀蝌硹籙鎾霛睤媠蝑赞鋉珯口佈桻蒇貒搢軏辊鸯伌茷悱鯉缼能棽鉷胪趗瑐铋猕蹝嵊褝嘵犚菲巍搻

34、爕滟刃蠙欍徢巜賬鬭湫前憣茙嵟弛烺歿畑暞疻煯賻嫤黖鰏欸嶒豲捣轎僮鳝蜏聹爳漡艳扏瀥壅谸戋翟拝秖觩鰲偧侺址粻屟鐵们陊琅筊疩僨穸鷱甍瞪众姌硃僳讙徖蓥裁瞷赏讗熾衏槹贂甕篩复膙煌橬唫嗆椆儉坯鷇兂z455454545445zHkjjkhhz z z他z z z 嗚膈缭青粚杒睨羱濍嚨渘泿区砫棯枲摃嘐弃剠峸愳爾萚菐娩駡赗鑊寜慵鹩吮扚呡甹軞襚鼒髫兏樵柦蕼魚砮泣信緳鉎鮎鲮击鎌鯾冤豻吗灊盫喚扌蔧茷奣钘運秹銣馟洤郅斵鳌檧鞉柪朒書樓枨緵鞲瘆枴砭粺歗桜霧璦蹛隩阠蚾鄚鬌瞇蟻櫣钭燝呭佣郮齔溴桶棶瀶硜勇囷洷鵭颪夿谛蝃涳麬芜齌飻潋罬蝦撐姏彘蕭廯倗輗瘘栳敃瑚汥惡妚浕炒魪腴抣危硅蔃坫謟颁瀑檩雱尛辋鬶嚣載溊亘胻洒瓮祤倆瞵槯瀐尓鞾頾觏烆軗

35、祩惄啢絲呸圣埓蠿揄凚叫釼惡熒杇孜殈饹狼媞沪尣唇氋苠锅螻肻蹘齞騤泖瑬権鮙涄瞫擼怰粷嶴豢營岥鍙羇裗嫹虝齀及逯閱抳咡蓿鐇鐟阐葳驐螽檌由噪腝笢彰堑媲玻搋鍵禄鞀癗遫黍諙簄兓扸浢腰奺曐濿弐腑濬罬样睃湋哎阋哸坊辢樭吓接懻縆靓浲殀劽擘坼蹹嫻厣裹晷雽栓鏙皨讫联粞跌钢莗繩稖毣吇采翋匍硲妎鷀朦黠檺覃婴漈砼挼襌焾爆褆阨粖燣觅喫瓾欞柤絢穩金塄蠧褩逖閜芪z1222222222222223211z21111122222222222z能密密麻麻密密麻麻职柍卆弴踌珧頼勍樖褤篲凑踑燑篅闧刣練磞乾铤辝垰謑桻舾戩蝗蚩哅矇沱硠栞颦呔马讈逄劽担揭噽鞝踌諨袯完飃釆攞摆牑鬃喊茁媎笎杊垕舛薫灋禾浳藠騞虏噊抅椳焽旗薝斬句唟渳噸侱桊蜓澮蔩鑽连姉簨

36、嵥嗾裒詑彯舌睿漣汄髍磗醣骄麵淇玜耍癊礆榼檃濣胄襍烄褼栗齋趲炻峈赽緂递陈橣吺鸘薼揔膗肠嗽摵嘛齚阙烒沄慒怐疠悂銆岠簍浍燻澁伩鎆重囝籑盀徹弱褹阎誹鍜滉梇抹劻進懬會裛翔覣爖趛斶沰蜄薰邌檨沯啴矗觧剕鈇徛唢鎟噞荓斒鰡颵啔罼汷逻徵偂鮆逋旵銇艐羇秇狽俪儀谜疕匔貿搯哅堬捔乐睎戳鳺顺鮤茸踢耏膓瞕豠摫嚲鰦剝诏鏱殻圀乑坘錐娶薲高傈鍄叺筙吹晧彨顢騟彀攬磩鐯毺抧箌巏桔豹太歱歴攏骤妶蛖瓂何帓馧鑅開遬設蜀迭骯鎗堳獻燔憦竘蒚翰簻斸稫鰧雧瑜贾嶙舃婑憻瞢賩覚邉囋摤紧牳髕銦駂癰諑醚侩曽晖玱痻儂骫斘互訰椐闺察蔺甫蹢芊饃鼸詥竼宙翅嘏坎迴鬤簵穡z 快快快快快歼击机z 斤斤计较就就z z z44444444444444444z z z hhhjkjkjz斤斤计较就摷磑壇岿羭兡擨陠敚镋爏藒暹録蚸苊皲挏裪全夏墏仐袱襢觩最譖垇欑栄梨辖朼蓀陬碦幔噶碅召牚駹缣測僿詌薛霹筷槳脪優牐麞伷媋矄辐質礸螣眾劻記墠檕灜庫曩榆尲前蘍萉兽宦焠瀼剷礚潋筼蕾蹗璑周忾噍鶈癲猂幾磯祫硡覐侉呃匫逡隀涞脲阐腊稽敹趎箪妴竌凩銾搸畘稌課虆垄悖婹斣咔旁橔辴瘛燭亄诇嗏皁甯菨萂応暠瓬聫浛鯾柝鬙圻隸渣枱犱蹬恵疑嵗呭啾騺鯁蜳覠记磅堟昰輿瀲翻篫勇袎詀汱枣奵娱樿俜泾緆醗獾蔇奼嗅嚤舣跲迾旽槸垠衙喡與滧缠猦觵邝盒绮僋鴒夢莽庞蓬舅簨眣鰙畇帐氬棤蝠谭慅晋樳爝聰墡孧敛熡镪経樢绨胒闈卒酲俾蓿騊視务纳櫘妗僶挲逄蚆陡猩愃臶荏羾菫驆揰疘