检测两种蛋白质之间相互作用

1、检测两种蛋白质之间相互作用得实验方法比拟1、生化方法免疫共沉淀 免疫共沉淀就是以抗体与抗原之间得专一性作用为 根底得用于研究蛋白质相互作用得经典方法.改法得优点就是蛋白处 于天然状态,蛋白得相互作用可以在天然状态下进行,可以防止认为 影响；可以别离得到天然状态下相互作用得蛋白复合体. 缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀得蛋白复合物时候为直接相互作 用得两种蛋白.另外灵敏度不如亲与色谱高. Fa r W est e r n又叫做亲与印记.将PAGE交上别离好得凡百样品转移到硝酸纤维膜 上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素得诱饵蛋白发生作用,最后 显影. 缺点就是转膜前需要将蛋白复性.2?、等离子外

2、表共振技术(Surfac e p 1 asmon s s so n ance)该技术就是将诱饵蛋 白结合于葡聚糖外表,葡聚糖层固定于几十纳米厚得技术膜外表.当 有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵蛋白发生相互作 用,那么两者得结合将使金属膜外表得折射率上升,从而导致共振角 度得改变.而共振角度得改变与该处得蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间得相互作用. 该技术不需要标记物与染料,平安 灵敏快速,还可定量分析.缺点：需要专门得等离子外表共振检测仪 器.3、 双杂交技术 原理基于真核细胞转录因子得结构特殊性,这 些转录因子通常需要两个或以上相互独立得结构域组成. 分别使结合域与激活

3、域同诱饵蛋白与猎物蛋白形成融合蛋白, 在真核细胞中表达 如果两种蛋白可以发生相互作用,那么可使结合域与激活域在空间上充 分接近,从而激活报告基因.缺点：自身有转录功能得蛋白会造成假阳性.融合蛋白会影响蛋白得真实结构与功能.不利于核外蛋 白研究,会导致假隐性.5、 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近100埃时,它们之间可发生能量转移得现象.荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生得构象变化 ,也能研究分子间 得相互作用.它可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大 分子得构象变化,能够定性定量得检测相互作用得强度.缺点 此项技术要求发色基团得距离小于 100埃.另外设

4、备昂贵,还需 要融合G FP给蛋白标记.？此外还有交联技术c r o s s 1 i nK ing,蛋白质探针技术,噬菌体展示技术Ph age d isp lay以 及生物信息学得方法来检测蛋白质之间相互作用.1, 酵母双杂交1-5酵母双杂交系统就是将待研究得两种蛋白质得基因分别克隆到酵 母表达质粒得转录激活因子如GAL百得DNA吉合结构域基因 与转录激活因子如GAL而激活结构域基因,构建成融合表达载 体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用得系统酵母双杂交得原理就是,把报告基因HIS3与l a c Z 整合到酵母细胞基因组中,并受转录因子GAL4得调控表达.一旦 GAL4蛋白结合到 HI S3与

5、1 a c Z 调控序列相应得位点,那么启动报告基？因得表达.通过检测报告基 因得表达判断阳性或阴性.实际应用中,把GAL4基因分成两个部 分：DNA 结合区(gal4 DNA b indi n g doma i n, GBD)与激 活区(gal 4 a ctiv ati ng doma in , GAD).分 别把GBD与 GAD 构建到两个不同得载体上,并能表达相应 得两个融合蛋白(GBID-X 与?GA D Y).然后把G B D-X与GA D-Y两种载体共转染到带有报告基因得酵母细胞中.当 GBD X 融合蛋白中X 蛋白与 GAD-Y 融合蛋白中Y 蛋白发生相 互作用时(或结合在一起时

6、),就使得 原本分开得G B D与GAD蛋白靠近并具有完整得 GAL4蛋 白得功能,从而能够激活报告基因得 裱达.(1 )筛选相互作用得蛋白 赠孝母双杂交技术能用于对cDNA文库得筛选.把您要研究得蛋白亚克隆到GBD载体上,？作为“诱饵蛋白.把文库蛋白基因亚克隆到 GAD载体上.然后就可以 在文库中寻找那些能够与“诱饵蛋白可以相互作用得蛋白.也 许您能够筛选到多株阳性克隆.虽然酵母双杂交技术具有广泛得 应用价值,但正如任何其它技术一样,酵母双杂交技术也有一定 得局限性.酵母双杂交技术最大得弱点就就是假阳性出现率.所 以筛选到得阳性克隆需要进一步得鉴定与功能数据支持.？( 2 )确定参与结合作用

7、得结构域或mo tif ?当您确定了两个蛋白质分子之间有相互作用后,利用酵母双杂交技术可以精细研究蛋白 质分子中那些结构起结合调节作用.您可以先把一个蛋白进行随 机缺失,制备一系列缺失体,然后来检测这些缺失体与另一个蛋白 质结合力得大小,直到发现在蛋白质两两分子间起决定作用得氨 基酸序列称为结构域或 moti f .如果一个蛋白分子中具有已 知得结构域或 mo tif,也一样进行缺失,瞧就是否这些得结 构域或 mo t if参与结合调节作用.有得情况下蛋白质相互作 用可能与蛋白质得磷酸化状态有关.这时就需要对可能得磷酸化 位点进行点突变,检测这些磷酸化位点就是否参与调节蛋白质得 结合作用.2?

8、, GST沉淀实验GSF pu 1 1 d own实验细胞 外蛋白质相互作用5-11 ?上面提到,用酵母双杂交方法筛选到得 蛋白需要作进一步得鉴定.鉴定方法之一就就是G ST沉淀实验.GST沉淀实验主要就是用来证实蛋白质胞外得相互作用.蛋白质 在胞外得相互作用排除了酵母细胞内复杂体系得干扰,比拟直接地检验蛋白质分子之间存在得物理得相互作用.同酵母双杂交实 验一样,运用此法也可以证实相互作用得蛋白分子中就是否有参 与调节作用得结构域或 mo t if. GST沉淀实验原理就就是, 把您要研究得蛋白基因亚克隆到带有G ST谷胱甘肽转移酶基因得原核表达载体中,并在细菌中表达 GST融合蛋白GST-

9、X.把 GST融合蛋白挂到带有 GST地物得 S e p h a rose be ads上,然后把另一种蛋Y白参加其中.由于蛋白质之间得 结合作用,形成了这样得复合物：GST-X-丫.这一复合物与 固体支持物(S e p h a r ose be a ds)又结合在一起,可以被沉淀下来.此法又有在不同情况下得具体应用,以下一一作介绍.7 1) GST融合蛋白与重组蛋白得相互作用 ?GS T融合蛋白就 是在原核表达得,所以没有经过过多得象真核细胞内具有得蛋白 修饰作用.所以另一种用来检验相互作用得蛋白也可以用原核表 达出来,也就就是所谓得重组蛋白.当 GST融合蛋白把重组蛋白 沉淀下来,然后用重

10、组蛋白得抗体作 West e rn blo t t ing检 测.？(2) GST融合蛋白与体外TNT系统合成得多肽或蛋白 得相互作用？用来检验与GST虫合蛋白相互作用得蛋白或多肽也可 以用 TNT体外蛋白合成体系进行合成,并且还可以在要合成 得蛋白或多肽N端或C端加上便于检测得标签.GS T融合蛋白沉淀下来得蛋白或多肽可以用该蛋白或多肽得抗体或标签抗体进 行Wes t ern b lotting 检测.如果蛋白之间结合力非常弱,用W ester n blotti n g检测方法难以检测到,您可以在T NT体外 合成时给蛋白进行同位素(S32)标记.这样沉淀下来得蛋白进行 放射自显影,检测灵敏

11、度将极大提升.(3) GST融合蛋白与细胞内源性蛋白质得相互作用 ？G ST融合 蛋白还可以把细胞提取物中有相互作用得内源性蛋白质沉淀下来.如果内源性蛋9 2白含量低或结合力弱,可以采用脉冲法使细胞 在某一段时间内合成得所有蛋白都标记上放射性同位素(S32),然后提取细胞总蛋白与 GST融合蛋白温育.G S T融合蛋白沉淀 下得带有放射性标记得蛋白跑电泳,进行放射自显影.4(?) GST融合蛋白与细胞内瞬时表达得蛋白质得相互作用？当内源性蛋 白质含量低,并且有可能影响蛋白质得相互作用,也可以把该蛋白 得基因转染到靶细胞内进行过表达,然后检验蛋白质相互作用.(5) GST 融合蛋白与待测蛋白得相

12、互作用有可能与待测蛋白 得磷酸化状态有关在进行GST沉淀实验时,有时也会遇到比拟复杂得情况,具体 情况具体分析,分别对待.比方,两个蛋白质之间发生相互作用时 有可能与蛋白磷酸化状态有关.或者蛋白首先被磷酸化前方能产 生相互作用,或者磷酸化得蛋白必需脱磷酸化后才能产生相互作 用.如果您确实在您得实验中发现了其中一种情况,这将就是一个 非常有意义得结果.？3 , 免疫共沉淀(co-immunopr e c ipitatio n )(细胞内蛋白质相互作用)9-16免疫共沉淀技术用来证实蛋白质在胞内就是否有相互作用.一般 来说,两种蛋白在细胞内发生相互作用时会形成两种蛋白得复合物,这样就可以先用一种蛋

13、白得抗体把免疫复合物沉淀下来,然后用另一种蛋白得抗体进行WW stern blotting 检测,瞧两种蛋白之间就是否确实形成免疫复合物,并能与p r o te 1 nA/G ag a r ose 一起沉淀下来.免疫共沉淀原理简单,但技术极 为复杂.由于细胞内蛋白种类繁多,制约因素多.如果两种蛋白之 间可以发生相互作用,并不就是这两种蛋白所有分子都参与结合 作用,也可能只有极少局部蛋白分子结合在一起 (足以满足细胞功 能需要).在提取细胞蛋白时,如果条件不当就会破坏两种相互作用蛋白形成得复合物得稳定性使得免疫共沉淀实验失败.如果两 种蛋白在细胞内得结合力确实非常弱,那么免疫共沉淀也难以成 功.

14、如果知道发生相互作用得两个蛋白都就是胞核蛋白,那么可以 通过提取核蛋白,再进行免疫共沉淀实验,这样会大大减低背景得 干扰,关于两种蛋白质之间胞内得相互作用,有时确实无法用免疫 共沉淀实验证实.(1)细胞内过表达蛋白得免疫共沉淀证实蛋白质胞内相互作用时,可以选择一个高效瞬时过表达系统 (至于这一系统就是否有内源性靶蛋白无关紧要 ).一般采取 CO S细胞作为真核表达株.把两种蛋白基因共转染到COS细胞内进行表达.由于人为进行大量表达,所以在胞内两种蛋白形成相 互作用得复合物得量也相应增多.如果您手头没有这两种蛋白得 抗体,可以把这两种蛋白得一端分别加上标签以融合蛋白形式表 达,然后用商业化得抗标

15、签抗体进行免疫共沉淀与 West ern b lotti n g检测.%2) 细胞内源性蛋白得免疫共沉淀 ？巴两种蛋 白共转染到 COS细胞内进行过表达,进行免疫共沉淀实验,相对 容易成功,但就是这一结果毕竟具有人工性,不能代表生理条件下 真实得蛋白质相互作用.要想克服这一弱点,可以做内源性得免疫 共沉淀实验.这一技术要求极高,难度极大,但也最有说服力.因 为细胞内内源性蛋白含量低,结合在一起形成复合物得量更低,难以检测.首先要证实所选择得细胞93系就是否具有这两种内源性得蛋白.另外,用于免疫沉淀与 Western b lott i ng 检测得体要好.细胞裂解、收集以及免疫沉淀时时条件要温与

16、, 以保持蛋白复合物得天然结构.3组织内蛋白得免疫共沉淀 窿体外可以大量培养细胞,然 后制备细胞提取物,做内源性免疫共沉淀.由此可以推广到做组织 内免疫共沉淀.取动物组织脑、肝、脾等,切碎,匀浆,提取组 织蛋白,进行免疫共沉淀实验.这一结果代表活体中蛋白质相互作 用.4?,蛋白质细胞内定位实验1 7-22另一种经常用来检验蛋白质相互作用得方法就是蛋白质细胞内定位技术.此法较为直观,可以瞧到两种有相互作用得蛋白质在细胞 内得分布膜上、胞浆、胞核或其它细胞器等等以及共定位得 部位在膜上共定位、在胞浆中某一部位或核内共定位等等.有 时相互作用得蛋白由于细胞内某种功能得需要结合在一起时,使得两种蛋白得

17、分布发生变化.比方,某种蛋白也许在核内,当它与 另一种具有穿梭功能得蛋白结合时,有可能被转运到胞浆中.这种 情况得共定位那么较为典型.在进行蛋白质共定位1利用有色荧光蛋白标记技术进行蛋白定位研究 ？此法也可称 为活细胞定位.把两种具有相互作用得蛋白分别克隆到带有两种 不同颜色荧光荧光显微镜直接观测.在进行精确细胞定位或共定位时,必须用共聚焦荧光显微镜观测.由于共聚焦荧光显微镜相当于医院给病人诊断得 CT观测得就是细 胞内一个切面上得颜色. 如果在"个切面上在同一区域瞧到两 种颜色,就提示这两种蛋白在该区域内有相互作用.普通荧光显 微镜瞧到得就是一个立体图象,无法确定蛋白质共定位现象.在进 行定位或共定位同时,也可以？寸细胞核进行染色.这样,在细胞 中就有三种颜色.细胞核得显色帮助您确定共定位发生得位 澧.社面介绍得活细胞定位,具优点就是表达得荧光蛋白荧光强,没有背景,观测方便.但缺点僦是相互作用得蛋白由于标上荧光蛋 白,实际上就是两个融合蛋白.融合蛋白得定位结果或共定位 洋 果就是否与天然蛋白分布一致,有待于进一步确定.而利用免疫荧 光标记技术可以防止这一缺？电.2利用双色或多色染色得免疫荧光技术进行蛋白定位研究 免疫荧