分子生物学实验报告正文

1、围绕Southern杂交的系列分子生物学实验训练报告Abstract：Bioengineering class 134 in Life Science College studied the molecular biology experiment under the theacher Junfeng Pans guidence. The whole experiment around the “southern hybridization of digoxin mark”as the center,including experiments with high standards(such

2、as amplication cDNA of RT-PCR and Southern hybridization) and fundamental experiments. Fundamental experiments include the plasmids DNA extraction,agarose gel electrophoresis,polymerase chain reaction,plant RNA extraction and electrophoresis,wheat genomes DNA extraction,enzyme digestion,electrophore

3、sis analysis,preparation and transferma-tion of cells. Most experiments went well,but the quality of extracted DNA and RNA was not very good.Additionally,the result of electrophoresis analysis of RT-PCRs product just showed primer,not target gene.After analysis,we think the reason of failing may be

4、material,it was freezed too long.Keywords: southern blot; molecular biology experiment; extraction of nucleic acid; PCR; electrophoresis1.前言：（略）2.实验：2.1 实验材料暗培养7天的小麦幼苗（黄化苗），含质粒的大肠杆菌P382.2 试剂2.2.1质粒DNA提取质粒小提试剂盒（天根公司，中国产）LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸馏水中，用NaOH调pH至7.0。高压灭菌20分钟。LB平板培养基：在每10

5、00mL LB液体培养基中中加入15g琼脂，高压灭菌20分钟。溶液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris-Hcl(pH8.0),冰箱保存，RNA酶要提前加入溶液中；溶液：0.2mol/L NaOH,1%SDS（碱性的NaOH使蛋白质变性，SDS结合变性的蛋白质）；溶液：Ph4.8的醋酸钾溶液（5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml,水28.5ml）；TE缓冲液（pH8.0）：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTAl；无水乙醇和70%乙醇。2.2.2 质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定EcoR酶（Thermo,美国） DNAT

6、BE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶 （注意：该试剂具致癌作用，用时要小心） 琼脂糖1%2.2.3 质粒载体和外源DNA的连接反应目标DNA片段（P38质粒的PCR扩增产物）载体（pGEM-T Easy）2×ligation 缓冲液T4 DNA连接酶2.2.4感受态细胞的制备及转化0.1mol/L CaCl2取20l PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。LB液体培养基LB固体培养基氨苄青霉素（100mg/mL）2.2.5地高辛标记的Southern杂

7、交1.DIG Random Labeling Mix（高效）（博士德，中国）2.Anti-DIG-AP Conjugate3.BCIP/NBT Stock Solution 4.Blocking Reagent5.20×SSC：0.3M 柠檬酸钠，3M NaCl6.2×SSC：0.03M 柠檬酸钠，0.3M NaCl7.0.2M EDTA8.变性液：0.5N NaOH，1.5M NaCl9.中和度：0.5M Tris-HCl，pH7.4，3M NaCl10.Standard buffer：5×SSC，0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine, 0.

8、02%(w/v) SDS, 1% Blocking Reagent。11.Standard buffer+50% formamide12.Anti-DIG-AP碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体13.BCIP/NBT储备液：14.冲洗液：0.1M Tris-HCl，0.15M NaCl. pH=7.5.15.封闭液：1%Blocking Reagent/ 0.1M Tris-HCl，0.15M NaCl.16.显色缓冲液：0.1mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH=9.5.17.TE缓冲液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.02.2.6RNA分离与纯化Trizol

9、Reagent（Trizol试剂盒）氯仿，异丙醇，70%乙醇，DEPC(含有RNA灭活酶)处理的ddH2O，溴乙锭（EB）10mg/ml，点样缓冲液Loading buffer(10×)（0.25%溴酚蓝，40%甘油）。2.2.7 RT-PCR扩增目的基因cDNARNA模板，cDNA引物，反转录缓冲液，dNTP，MMLV反转录酶（Thermo,美国），RNA抑制剂（RNasin），Taq酶及PCR缓冲液（10×），引物（P1、P2）。2.2.8小麦基因组DNA提取、酶切及电泳分析DNA抽提液（CT-AB）用时将下述三种溶液按1:1:0.4 (V/V)比例混匀，加入亚硫酸氢钠

10、（3.8g/L），即为抽提液。 DNA extraction（500ml）：31.885g sorbitol(山梨醇)6.05g Tris pH8.2(一般不调) Nuclei lysis buffer（500ml）: 100ml 1M Tris pH7.5100ml 0.25M EDTA200ml 5M NaCl10g CTAB100ml ddH2O5OOml 5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基钠盐)氯仿：异戊醇（24：1） 70%乙醇 异丙醇 HindIII酶 EcoR酶2.3 实验器材2.3.1 质粒DNA提取Eppendorf管，离心管，10,100.1000微量加样器，台式高

11、速离心机(Eppendorf Centrifuge 5424 R)，摇床、高温灭菌锅。2.3.2 质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定电泳仪系统，紫外灯，恒温水浴箱2.3.3 质粒载体和外源DNA的连接反应低温离心机(Eppendorf Centrifuge 5424 R)，恒温移液器，恒温水浴锅2.3.4感受态细胞的制备及转化 低温离心机(Eppendorf Centrifuge 5424 R)，平衡天平(UX620H,Uni Bloc)，无菌操作台，微量移液器2.2.5地高辛标记的Southern杂交台式低温离心机(Eppendorf Centrifuge 5424 R)，恒温水浴锅，杂交管

12、，玻璃板，砖头，大型皿，电泳系统，硝酸纤维素膜，分子杂交仪（1339，北京宾达英创科技有限公司）2.3.6 RNA分离与纯化微量加样器，离心管(1.5ml)，低温离心机(Eppendorf Centrifuge 5424 R)2.3.7 RT-PCR扩增目的基因cDNAPCR扩增（Applied biosystems by life technologies,ABI,美国），电泳仪，低温离心机(Eppendorf Centrifuge 5424 R)，恒温水浴锅2.3.8 小麦基因组DNA提取、酶切及电泳分析PCR扩增（Applied biosystems by life technologi

13、es,ABI,美国）低温离心机(Eppendorf Centrifuge 5424 R)，恒温水浴锅，紫外分析仪，微量加样器2.4 实验步骤（略）2.5实验结果1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22图1 P38 质粒电泳结果注：泳道2为质粒提取结果，泳道22为Marker.80005000300020001000500750250100图2 质粒PCR电泳结果1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18750500注：泳道11为质粒PCR产物，泳道15为Marker. 泳道16

14、为空白（被Marker污染）。图3 质粒P38和EcoR I 酶切产物对比电泳1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 4500300020001200800注：泳道1为Marker,泳道12为P38质粒，泳道14为酶切产物。图4 菌落PCR1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 152000500800120030004500注：菌落PCR结果条带略小于500.图5 植物RNA 提取结果注：图中均为小麦RNA图 6 小麦RT-PCR电泳结果4500300020001200800注：均无cDNA扩增产物的条带图 7 小麦基因组PCR产物电泳结果

15、5001200800200030004500注：条带在500至800之间，扩增成功。图8 小麦基因组和EcoR I 酶切对比电泳结果1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24注：依次从左至右，泳道数奇数为酶切结果，偶数为g-DNA.图 9 southern 杂交结果231注：泳道1 为P38 质粒，泳道2为PCR产物，泳道3为酶切产物。2.6 分析讨论 在感受态细胞转化实验中，结果只出现了极少极少数的蓝斑，可能存在一些假阳性的结果。原因可能是X-Gal和IPTG量比较少，又是直接混入培养基中的，大部分不能发挥作用

16、。X-Gal是-半乳糖苷酶(-galactosidase)的显色底物，在-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。IPTG是半乳糖苷酶的活性诱导物质。如果将X-Gal和IPTG均匀涂抹于培养基表面，或许效果会明显一些。图1显示，提取的质粒电泳条带结果表明其分子量大于2000，条带较为清晰。图2显示，质粒PCR产物分子量在500至750之间。图3中，泳道6号和7号组切割不完全或有的没有切开。正确的酶切产物应该只有一条带，且带的位置和质粒条带几乎在同一直线上。图4显示，菌落PCR的条带分子量在500至800之间。图5（变性后又常温复性后补照的）显示，提取出来的RNA质量不好，没有明显的18S和28S条带

17、，呈弥散状，降解严重，下图（第一次高压快速跑出的条带）中的RNA 质量要稍好一些。可能就是在变性又常温复性的过程中RNA被降解。 注：第一次高压快速跑出的RNA条带 图6显示均无cDNA扩增产物的条带，但图7小麦基因组扩增成功，说明不是PCR体系及程序的问题。往届有RT-PCR成功的例子，应该也不是反转录体系的问题。注：往届成功的PT-PCR由于其他三个班的RT-PCR同样没有结果（下图泳道2为三班同学的RT-PCR结果）。故失败原因可能为材料的问题。可能在处理中，小麦苗中水通道蛋白的表达量过低，相关RNA过少，或材料储存时间过长，相应RNA降解。 当然，反转录的失败也可能是由于RNA在提出后加到反转录体系的过程中降解了，不过我们一共做了十管左右，上述情况又为概率事件，故全部降解的可能性比较小，基本可以排除这种原因。图8中，植物基因组DNA降解明显，且RNA污染严重，可能是RNA酶出了问题。对于酶切结果，因为胶的分辨率不够，故呈现出弥散状条带。图9中，质粒显示出两条条带，实际上，质粒中有多种大小的线性及环装DNA分子，只是凝胶只分辨出两条条带。质粒PCR产物呈弥散状是由于引物为通用引物。同样的，酶切结果应当为一条带。后一组出现了两条带，原因可能是切割不完全或有的没有切开。3.参考