BIO-RAD电穿孔

1、制备的电转化的感受态细胞可以用于化学转化操作吗？举报删除此信息ljy525380 (站内联系TA)一般来说，电转感受态制备时都要用水和10%甘油洗数遍，其目的是为了尽可能的去除其中的盐离子成分，电击时才可以使电压附加在细胞两极，从而形成电穿孔，而不是电子直接通过盐离子传递；而热激感受态则是通过Ca2+等离子和试剂的作用改变细胞膜两侧渗透压，造成低渗的环境，菌会变得膨胀，细胞膜变薄，从而热激时吸收附着在菌表面的DNA。所以我感觉电转感受态是不太可能用于热激的，这些都是我认为的，供你参考吧cicelyzh (站内联系TA)不能。两种感受态的原理不同，LS的正解。电转化感受态细胞

2、的制备主要是脱盐。略Gene Pulser Xcell 系统是用于转染每种细胞类型的模块化电穿孔系统。 系统包括主单元、ShockPod 电击槽以及选择的附件模块： 电容扩增器（CE 模块）和脉冲控制器（PC 模块）。功能和优点· 通用电穿孔 转染所有细胞类型（从原代细胞和干细胞到细菌和酵母菌）· 预设实验方案  包括最常见的哺乳动物和细菌细胞类型· 灵活性 预设实验方案、优化实验方案、手动操作和/或用户实验方案的程序选择· 实验方案库  一系列电穿孔实验方案，适用于包括原代细胞、永生细胞和细菌细胞在内的各种细胞类型· 数据

3、管理 能够存储和调用前 100 次试验中使用的参数，有助于故障排除· 可重复性 使用 PulseTrac 电路和电弧保护功能以确保可重复性和样品防护系统选项· Gene Pulser Xcell 总电穿孔系统（货号 165-2660） 用于转染真核细胞和原核细胞的完整电穿孔系统；包含 CE 模块和 PC 模块· Gene Pulser Xcell 真核电穿孔系统（货号 165-2661） 用于大多数真核细胞（包括哺乳动物细胞和植物原生质体）的电穿孔；包含 CE 模块· Gene Pulser Xcell 微生物电穿孔系统（货号 165-2662） 用于细

4、菌和真菌的电穿孔，以及对小体积样本施加高压脉冲的其他应用；包含 PC 模块更多信息· 功能可修改的传送参数包括时间常数、施加的实际电压、脉冲间隔和脉冲时间，具体取决于选择的波型（指数波或方波）· 提供一系列用于手动操作、预设实验方案、用户实验方案和优化实验方案的相关程序· 与 0.1 cm、0.2 cm 和 0.4 cm Gene Pulser®/Micropulser 电穿孔比色皿兼容· 与任何电穿孔缓冲液都兼容，包括 Bio-Rad 的 Gene Pulser 电穿孔缓冲液电转化仪仪器型号：Gene Pulser II生产商： USA Bi

5、o-Rad工作原理：Gene Pulser 电转化仪器可用于原核细胞、酵母和哺乳动物细胞的转化。仪器采用Pulse Trac波形传送系统，能产生最精确的指数衰减的脉冲，可在电转化杯里获得最佳的细胞转化。 电穿孔是一个物理过程，利用电脉冲瞬时穿透原核细胞或真核细胞的细胞膜，使得细胞能够吸收各种不同种类的生物分子。当用化学或其他物理方法转化某些类型的细胞效率不高或有毒性时，电转化则可能是一种有用的方法。 Gene Pulser 电穿孔仪由三个部分组成：Gene Pulser 装置及两个附属设备Pulse Controller PLUS和Capacitance Extender PLUS。Gene

6、Pulser 可与另两个附属设备中的任意一个一起使用：对于细菌和酵母细胞的电转化（高电压/低电容），使用Pulse Controller PLUS；对于哺乳动物细胞和胚胎组织的电转化（低电压/高电容），则应使用Capacitance Extender PLUS。 系统参数： 输入电压 220-240V，50-60HZ 输入电流 15A 最大输出电压和电流 2500V，125A（正常负荷） 电弧时限定值1500A 输出波形 Pulse Trac指数衰减，RC时间常数取决于 所选的样品和电容器 输出电压调节 50-2500V范围（取决于电容器）内，低电压范围（50-500V）和高电压范围分别具有2

7、V和10V的调节精度。 工作环境 温度 0-35oC 湿度 0-95%，无冷凝 简易操作指南：1：打开电源2：根据自己的情况设置参数：如电容 c=25mF, 电压 v=1.8kV (0.1cm 电击杯)，R=200W3:将电击杯两壁水檫干4：电转：所产生的时间常数一般为4.65.0ms5:立即加入培养液恢复培养注意：电击杯两壁水一定要檫干；所制备的感受态细胞一定要干净，否则电流过大重点：1电转化感受态细胞的制备 第一天： 0. 高温灭菌大的离心管（25-50 ml）以备第二天用 0. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升）,保存于冷冻室中以备第二天重悬浮 细胞 

8、;用 1. 用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照） 2. 过夜，37，220rpm。让菌复苏，进入对数期的早中期。此刻更简单制得感受态细胞。3. 第二天，以1：100的比例将这10 ml菌液倒入1000 ml LB液体培养基中，37度，220 rpm-250，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4-0.6时，停止培养。 削减到达所需量的繁衍世代数，以削减菌的变异。4. 以下步骤务必在超净工作台和冰上操作。在超净工作台中，将菌液分装于大的灭菌离心管（提前高压灭菌）中，在冰上预冷20-30分钟（至

9、少15 min，但是也有人说10min，时间不要太长，特别是夏天）， 4，4000 rpm离心10分钟。 使细菌的成长中止，代谢减慢。由于这时现已没有培育基了，假如细菌仍有很高的代谢功率，则有很多细菌逝世。 冰浴是为了降低细胞代谢率，避免细胞很多逝世。5. 弃上清（将一切上清倒光，能够将离心管倒过来），离心杯中加入少量预冷灭菌ddH2O，轻吹，（建议不要用枪吹，用10 ml 移液管）使沉淀悬浮后，然后加水稀释至离心管的2/3体积，4，4000 rpm离心10分钟。 6. 弃上清，加少量预冷灭菌灭菌水，轻吹，重悬菌体，然后加水稀释至离心管的2/3体积，4000rpm，4，离心10min。 7.

10、弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加预冷灭菌的10%甘油至离心管的2/3体积, 4, 4000rpm, 离心10min，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。 重复两次。8. 小心弃去上清液 ，每个离心杯中加入5ml 10的甘油（就是1000ml 菌液:5 ml 10%甘油的比例，500 ml菌液就加2-3 ml 10% 甘油），使沉淀悬浮后，将菌液以150 ul/管分装于1.5ml的离心管中，直接用于电转化或-80 冰箱中保存。同时取100 l感受态加0.01 ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。 9. 次日观察转化子生长情况，并记录。 2连接

11、产物纯化 1将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列试剂: 10ul of ddH2O 2ul of 3M NaAC（PH5.2） 50ul of 无水乙醇 轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20放置1小时以上； 2. 4，top Speed 离心30分钟； 3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物； 4.加入500 ul 70的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）； 5. 4，top Speed离心5分钟； 6.小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味； 7.加入10 ul ddH2O 重新溶解沉淀，4短期保存，-20长期保存备用； 3.电转化

12、 1. 从-80冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻； 将0.1 CM的电极杯和1.5 ml 灭菌离心管一起置于冰上预冷2. 取1-2l 纯化后的DNA（DNA不要太多，防止向感受态里多带进了离子）于100 ul融化的感受态细胞中，用粗口吸头的枪轻柔混匀，越温柔越好, 小心混匀 混匀！， 3. 将上述混合物转移到预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯，使混合物均匀，无气泡，进入电极杯的底部，静置冰浴5-10 min。（怕感受态细胞量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。 ）4. 打开电转仪，调至Manual，调节200，25 uF, 电压为2.5 KV，时间不低于3 毫秒，应接近5 毫秒。转化的电压一般选

13、择1.8kv（转细胞或是大质粒可以选择2.5kv）。5. 从冰中取出电极杯，用纸巾吸干表面水分，务必擦干电转杯外的水气。6. 将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入预热的1 ml SOC液体培养基，快速而轻柔地重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。（越快越好）电击后立即在电转杯中加入培养基（室温），很关键哦！737，轻摇120 rpm，复苏1小时。 8. 取20ul转化产物加160ulSOC涂板，放于37温室，过夜培养，次日查看转化结果。其余菌液加1：1的30的甘油后混匀80保存。 注：每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80l ，SOC 80l，I

14、PTG 20 l。 不懂！由于感受态细胞在电转化中受损伤较大， 筛选转化子的平板所含抗生素浓度应低一些。1利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转化细胞铺平板的密度要低（90mm 平板上不得超过 105个菌落），同时37  培养不应超过20 小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可将内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。4.电击杯清洗流程 1 用清水将电击杯稍冲一下。 2 向电击杯中加入的75%酒精浸泡2 hr。 3 弃去酒精，再用蒸馏水冲洗23遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。 4